骨骼篇丨AAV在基因治疗中的应用：血清型、启动子选择与注射策略

骨骼系统通过其支撑身体、保护内脏器官、参与运动和造血功能以及调节矿物质平衡等维持身体健康,但由于多种因素的相互作用，机体功能易出现退化，导致包括骨质疏松、骨不连、遗传性骨病等发生。腺相关病毒AAV是基因治疗领域最常用的基因递送载体，在骨骼系统中的应用常选择特定血清型AAV载体将治疗性基因如抗炎因子IL-1Ra、软骨保护因子PRG4等递送至关节软骨、骨髓间充质干细胞（AAV2、AAV6.2）或成骨细胞（AAV9）等，改善骨关节炎症，实现骨组织修复再生和骨代谢平衡等，为骨骼疾病的治疗提供新策略。

骨骼系统骨组织细胞包含有：骨祖细胞、成骨细胞、骨细胞、破骨细胞（吸旧骨），及关节软骨中维持软骨弹性与抗压性的软骨细胞。体外实验中，rAAV1，rAAV4，rAAV5，rAAV6，rAAV7，rAAV9，rAAVrh.10和rAAVrh.39可转导成骨细胞（COB）；rAAV1，rAAV4，rAAV5，rAAV6，rAAV7和rAAV9可转导的破骨细胞前体（BM-OCP）；rAAV1，rAAV6，rAAVrh.10和rAAVrh.39可转导软骨细胞祖细胞（ATDC5）。体内实验中，AAV9能够有效转导成骨细胞、破骨细胞和骨细胞。AAV2和AAV6.2在体内外实验中均可有效转导软骨细胞。

图1 鉴定在体外和体内不同血清型AAV对骨骼组织的转染效率^[1]

图2 不同血清型AAV体内对软骨细胞的转染效率^[2]

感染骨骼系统常见的注射方式有尾静脉注射、骨关节腔注射、骨内注射等。

尾静脉注射是系统性给药，其操作简单、损伤性小，但特异性相对较差，病毒用量较大。

骨关节腔注射和针对骨髓的骨内注射特异性提高，感染效果较好但操作相对繁琐。

血清型：AAV6

启动子：CMV

实验动物：加速衰老Z24^−/−小鼠

注射方案：膝关节腔注射，2.5×10^12 vg/只，表达8周

实验结果：为实现向Z24^−/−小鼠膝关节递送TIPE2，将rAAV-CMV-TIPE2-GFP注射到Z24^−/−小鼠膝关节腔内，表达8周后，荧光显微镜下可见小鼠膝关节软骨组织有GFP 荧光，且GFP阳性细胞与HE染色共定位；对3只小鼠的统计显示，注射侧膝关节超89%软骨细胞呈GFP阳性，这表明该基因递送系统在小鼠膝关节软骨细胞中效率较高。

图3 AAV6-TIPE2载体成功递送至Z24^−/−小鼠膝关节软骨

血清型：AAV9

启动子：CBA

实验动物：C57BL/6J小鼠

注射方案：尾静脉注射，5×10^13 vg/只，表达8周

实验结果：给10周龄小鼠静脉注射单剂量携带对照、miR-214-3p或miR-34a-5p TuD的rAAV9；8周后，RT-PCR和microCT评估胫骨和血清中miR-214-3p和miR-34a-5p的表达水平和股骨骨量。荧光显微镜观察股骨骨骺区的EGFP阳性细胞提示其靶向骨内成骨细胞和破骨细胞。microCT发现miR-214-3p或miR-34a-5p TuD组比对照组股骨骨量低，小梁骨体积/组织体积（BV/TV）、小梁数量及厚度均显著降低。这表明rAAV9载体的全身递送在成骨细胞和破骨细胞谱系细胞中有效表达miR-214-3p和miR-34a-5p TuD，并导致体内骨质流失。

图4 rAAV9介导的miR-214-3p或miR-34a-5p TuD表达诱导小鼠骨质流失

启动子：CMV

实验动物：肥胖小鼠

注射方案：髓内注射，1×10^11 vg/只，表达8周；

实验结果：肥胖小鼠髓内注射AAV-miR-378a-3p-EGFP实现骨组织过表达 miR-378a。注射8周后。显微CT分析发现，与对照组相比，miR-378a 治疗组小鼠显示出明显更大的小梁骨体积和骨小梁数。免疫组织化学染色发现给予miR-378a-3p治疗增加了肥胖小鼠骨小梁表面的成骨细胞数量，减少了骨髓中脂滴的数量和面积。这些结果表明miR-378a 治疗减轻了肥胖小鼠的骨退化。

图5 miR-378a 过表达调节骨量和骨髓脂肪积累