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化学遗传学 (Chemical Genetics)

简介：

化学遗传学（Chemicalgenetics）又称药物遗传学，采用小分子活性化合物作为探针，以多种方式影响靶蛋白的功能，从而探索和控制细胞过程。该技术是对一些生物大分子实行改造，使其能和先前无法识别的小分子进行相互作用的过程，从而达到控制生物大分子活性的作用。这些小分子化合物除了揭示生命的基本活动规律外，还可能成为候选药物，从而应用于药物开发。

随着生物和化学交融的更加紧密，通过对生物体原有的配体与受体进行改造，得到了大量的具有外源物质激活、调节细胞通路的人工改造受体。目前改造的受体包括蛋白激酶、核酸杂交、各种代谢酶和G蛋白偶联受体，基于G蛋白偶联受体改造的化学遗传学受体有很多，从1991年构建的等位基因特异激活的基因编码受体（Allele-specific activation of genetically encoded receptors），到1998年构建的只能被合成配体激活的受体（Receptors activated solely by synthetic ligands, RASSLs）和基因工程改造的受体（Engineered receptors），再到2007年构建的只由特定药物激活的受体（Designer receptor sexclusively activated by designer drugs, DREADDs）（如图1）。现在DREADDs已成为应用最广泛的化学遗传学技术。

图1. 化学遗传学改造天然受体得到的人工受体(BryanL.Roth.Annu.Rev.Neurosci.2014)

DREADDs技术原理

DREADDs技术是指只由特定药物叠氮平-N-氧化物（Clozapine-N-oxide，CNO）激活或抑制DREADDs受体，这些激活或抑制后的受体会选择性地作用于不同的GPCR级联反应来调节细胞信号转导，包括激活Gq、Gi、Gs、Golf和β-arrestin。常用的DREADDs及其配体（如图2）。其中应用最广泛的是Gq-DREADD和Gi-DREADD。

图2. 常用DREADDs及其配体(BryanL.Roth.Neuron.2016)

1.Gq-DREADD（hM3Dq）

hM3Dq是从人毒蕈碱乙酰胆碱受体M3（hM3D）上改造的仅对CNO有反应的人工受体（DREADD），不再受乙酰胆碱激活。在一些神经元里，CNO结合hM3D后，激活Gq蛋白偶联的磷酸酶PLCβ，引起PIP2被降解，从而使得被PIP2关闭的KCNQ外向钾离子通道被打开，以至于细胞膜去极化，形成动作电位。在KCNQ或是Gq不表达的神经元里，hM3D的功能可能会有所不同。

2.Gi-DREADD（hM4Di）

hM4Di是从人毒蕈碱乙酰胆碱受体M4（hM4D）上改造的仅对CNO有反应的人工受体（DREADD），不再受乙酰胆碱激活。在一些神经元里，CNO结合hM4D后，激活Gi蛋白偶联的内向钾离子通道GIRK，使得细胞膜超极化，抑制神经元细胞动作电位发放。在不表达GIRK或是Gi的细胞中，hM4D的功能会有所不同。

3.化学遗传学技术实验步骤

激活或抑制神经元是通过激活或抑制DREADDs受体，而要想达到激活或抑制DREADDs受体的目的，就要选择相应的DREADDs受体。

DREADDs的操作步骤如下（如图2）：

1）选择符合实验目的的DREADDs受体；
2）将DREADDs受体基因和特异性启动子导入病毒载体并感染动物机体，使在靶细胞中表达DREADDs受体；
3）在合适的时间点给予（立体定位、腹腔注射或喂水）实验动物CNO（控制时间或剂量），激活或抑制DREADDs受体；
4）通过行为学或电生理记录神经元活性改变带来的变化。

图3. 化学遗传学的实验步骤

DREADDs技术优缺点

优点：

1）非侵入性：CNO可以口服和非侵入性给药(例如，通过饮用水)，无需埋置光纤。因此不会因为额外负重影响小鼠行为，可实现在小鼠完全自由活动的情况下调控特定脑区和特定神经元的活动；
2）药物作用时程长：CNO动力学预测神经元激活、抑制或调节的持续时间相对较长(例如，几分钟到几小时)；
3）实验操作简单：CNO介导的DREADDs的激活不需要专门的设备（如光纤、激光控制器等），不需要调试光强度、频率、波宽和占空比等参数；
4）安全性高：CNO已用于人类，是一种已知的广泛处方药物的代谢物。

缺点：

1）操作神经元活动的时间精确度不高：光遗传可以通过控制激光达到毫秒级别的精度，而化学遗传通过CNO连分钟级别的精度都很难达到，而且CNO作用在神经元上之后一般需要2小时才能从膜上清除。
2）刺激的强度无法掌控：化学遗传无法控制给予神经元刺激的量，更不能实时操控刺激强度；而光遗传通过改变光功率可以实时、精确地操控神经元的刺激强度。