葡萄糖是脑的主要能量底物，其代谢与神经活动、突触可塑性及认知功能密切相关；代谢紊乱与阿尔茨海默病、癫痫、2型糖尿病等疾病相关。但传统技术（酶传感器、微透析-质谱）时空分辨率低，无法满足细胞/亚细胞层面动态监测需求。
2025 年 11 月 12 日，发表于《Science Advances》上题为“iGlucoSnFR2: A genetically encoded fluorescent sensor for measuring intracellular or extracellular glucose in vivo in mouse brain”的文章，开发了第二代基因编码荧光葡萄糖探针iGlucoSnFR2，其通过将iGlucoSnFR1的环形排列增强型绿色荧光蛋白（cpeGFP）替换为环形排列超折叠绿色荧光蛋白（cpSFGFP）、优化小鼠密码子提高体内表达量等改造，具备更高的荧光变化幅度（∆F/F接近5）、更适配的葡萄糖结合亲和力（解离常数Kd约500 μM）及更优的亚细胞定位效率；该探针可靶向细胞质、细胞膜和内质网（ER），在细胞培养中能监测葡萄糖消耗、糖异生及ER葡萄糖外流，在小鼠体内通过光纤记录等技术，可实时检测脑内胞内/胞外葡萄糖动态，还能通过校准实现清醒小鼠脑内胞外葡萄糖绝对浓度测量，为哺乳动物葡萄糖代谢研究提供高时空分辨率工具。
图1 iGlucoSnFR2的设计与初步表征
为了验证iGlucoSnFR2对细胞内葡萄糖浓度变化的监测能力，研究人员将细胞质靶向的该探针及对照（cpSFGFP-HaloTag）、iGlucoSnFR1-HaloTag质粒瞬时转染HeLa细胞（图2），通过将iGlucoSnFR2与信号稳定的标签（如mRuby3）融合，实现绿色探针信号相对于无响应红色/远红色信号的归一化（校正蛋白质表达量差异、成像焦点漂移等非分析物因素导致的荧光波动，确保信号变化仅反映分析物浓度变化），经JFX650孵育后用多孔成像仪观察，以含不同浓度葡萄糖的缓冲液平衡细胞后加入10 μM Glutor（抑制双向葡萄糖转运体GLUT-1/2/3）处理，结果显示iGlucoSnFR2因更高的∆F/F与亲和力，荧光下降幅度显著优于iGlucoSnFR1且在5 mM外部葡萄糖时饱和，该结果在HEK293、U2OS、COS-7细胞系中得到验证；同时构建的高亲和力变体iGlucoSnFR2.H348H（Kd≈3 μM）在葡萄糖耗尽后监测到细胞质葡萄糖缓慢回升（浓度3~500 μM），提示细胞内储存库的葡萄糖释放，灌流实验进一步验证了探针的快速响应与恢复能力；ER靶向的iGlucoSnFR2在1 mM外部葡萄糖时即饱和，表明ER葡萄糖浓度高于细胞质（图2C），Glutor处理后其浓度下降，提示葡萄糖可从ER流出。
图2 iGlucoSnFR2报告了GLUT抑制对HeLa细胞内葡萄糖的影响
除了监测细胞质（及ER）葡萄糖耗竭外，iGlucoSnFR2可观察原代肝细胞（体内主要葡萄糖调节细胞）的糖异生（是指生物体利用丙酮酸、乳酸、甘油、生糖氨基酸等非糖物质，在肝脏（主要场所）和肾脏（次要场所）中合成葡萄糖或糖原的代谢途径）过程。将含肝脏特异性TBG启动子调控的cyto-iGlucoSnFR2-mIRFP670nano3的AAV8感染小鼠，提取肝脏后在多孔成像仪中观察肝细胞响应（图3）。肝细胞经2小时葡萄糖饥饿后，分别用“丙酮酸+乳酸（糖异生底物）”或“丙酮酸+胰高血糖素（直接刺激糖异生）”处理，均使iGlucoSnFR2荧光升高，且胰高血糖素效果更优。鉴于GLUT介导葡萄糖双向转运，探究BAY876（阻断GLUT-1）与Glutor（阻断GLUT-1/2/3）对胞质葡萄糖的影响，两种药物均提升胞质葡萄糖浓度，Glutor效果更显著（图3，红/橙色vs黄/绿色曲线）；且仅在Glutor存在时，胰高血糖素可显著提高葡萄糖浓度（图5，红vs橙、黄vs绿曲线）。
图3 iGlucoSnFR2可检测肝细胞在刺激性处理及葡萄糖转运抑制条件下的糖异生反应
此前研究显示，iGlucoSnFR1可报告果蝇脑外植体及斑马鱼胚胎的胞内葡萄糖变化，但在哺乳动物体内的实用性未被证实。基于iGlucoSnFR2在细胞培养中的优异性，研究在小鼠下丘脑腹内侧区（MBH，调控能量平衡与葡萄糖稳态的关键脑区）对比两者性能（图4A），向下丘脑腹内侧区注射编码cyto-iGlucoSnFR2-mRuby3或cyto-iGlucoSnFR1-mRuby2的AAV，2-4周后以光纤记录监测荧光。结果表明，iGlucoSnFR1对腹腔注射葡萄糖（图4B-D）、胰岛素（图4E-G）的响应幅度温和且信号嘈杂；而iGlucoSnFR2响应强烈且信号清晰，还能监测去甲肾上腺素处理后的胞内葡萄糖变化（去甲肾上腺素通过刺激肝糖生成等升高血糖）。综上所述，iGlucoSnFR2比iGlucoSnFR1更灵敏可靠，可用于观察哺乳动物活体脑内胞质葡萄糖动态。
图4 比较cyto-iGlucoSnFR2与cyto-iGlucoSnFR1在检测体内神经元葡萄糖动态变化时的灵敏度
iGlucoSnFR1难以有效靶向哺乳动物细胞膜，而采用SFGFP及啮齿动物优化密码子的修饰，显著提升了mem-iGlucoSnFR2的膜定位效率（图1C），mem-iGlucoSnFR1则完全无法定位。神经元培养中，膜定位iGlucoSnFR2可即时响应胞外葡萄糖浓度变化，细胞质探针响应略慢。基于此，在小鼠背外侧纹状体神经元中表达mem-iGlucoSnFR2-mRuby3（图5A），免疫染色证实其定位于细胞膜（图5B），并通过光谱分辨光纤记录法进行体内检测，该技术可经光谱解混分析消除信号串扰与血红蛋白吸收干扰。自由活动小鼠实验中，探针对腹腔注射葡萄糖呈强烈荧光升高响应，对生理盐水无响应（图5C-G）；注射多巴胺D1受体拮抗剂SCH23390后，神经元放电受抑制、葡萄糖利用减少，胞外葡萄糖积累被成功检测（图5E-G）。
图5 自由活动小鼠纹状体细胞外葡萄糖动态变化
为了验证皮层内电刺激对胞外葡萄糖的影响，监测M1（向纹状体有谷氨酸能投射，图6A）电刺激后的纹状体动态，刺激引发胞外葡萄糖快速（~100ms内）瞬时升高，600 μA刺激响应显著强于300 μA且持续更久，自由活动动物中还观察到刺激后约1秒的二次升高（图6B-E）。这些结果证实，iGlucoSnFR2可通过神经血管耦合机制介导的刺激强度依赖性响应，监测脑内胞外葡萄糖动态，验证了其在活体实时代谢传感中的灵敏应用价值。
图6 皮层刺激对自由活动小鼠纹状体细胞外葡萄糖水平的影响
为了验证iGlucoSnFR2高分辨率成像能力，在小鼠桶状皮层星形胶质细胞和神经元表面（CAG启动子调控）表达该探针，采用双光子荧光+自适应光学技术（AO2P）校正像差，成像深度达480 μm（图7A）。静脉注射D-葡萄糖后iGlucoSnFR2-mRuby3荧光比值升高，胰岛素处理后降低，L-葡萄糖无响应（图7D）；用葡聚糖偶联染料Cy5.5标记血管避开血红蛋白干扰，借助mRuby3发射光进行平移运动校正。
为了在体内校准膜靶向iGlucoSnFR2的荧光信号，小鼠过夜禁食后静脉注射胰岛素（2 IU/kg）降至低糖水平，再以递增剂量（0.25-4 mmol/kg）注射葡萄糖，同步用体外37℃预校准的电化学（EC）探针来测量sV1区胞外糖浓度（图7B），可直接测量D-葡萄糖的绝对浓度变化。结果显示，0.08~0.62 mM范围内，探针荧光与胞外葡萄糖浓度呈线性相关（图7C）。
对清醒小鼠初级体感皮层sV1皮层I层进行AO2P成像，以1 Hz时间分辨率、亚微米空间分辨率绘制胞外葡萄糖空间分布图（图7D），按1分钟荧光强度权重计算像素∆F/F0，绘制胰岛素（2 IU/kg）、L-葡萄糖（8 mmol/kg）、D-葡萄糖（8 mmol/kg）处理后的分布及无血管重叠区域的时间动态曲线；对微小血管放大成像获更高分辨率（图7E）。两种尺度下，静脉注射葡萄糖在胞外均匀分布，探针荧光峰值晚于血糖峰值，表明脑内葡萄糖摄取受血脑屏障（BBB）转运速率限制。
图7 利用电化学测定的葡萄糖浓度对胞外iGlucoSnFR2荧光进行体内校准
第二代葡萄糖探针iGlucoSnFR2能实现亚秒级时间分辨率（如电刺激响应）、亚微米空间分辨率（AO2P成像）；可靶向细胞质、膜、ER，适配细胞培养与活体动物；结合EC探针可实现体内葡萄糖绝对浓度测量。荧光信号受探针表达量影响，需依赖mRuby3等归一化标签。可用于探索神经血管耦合机制、细胞间葡萄糖转运；可用于糖尿病、阿尔茨海默病等疾病模型的脑葡萄糖代谢异常定量评估，为药物研发提供精准的体内疗效评价指标。
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