快速视觉逃避是动物在面对突发威胁时的重要生存行为。然而，使大脑和身体进入“快速行动准备状态”的神经生理机制仍不清楚。腹侧被盖区（VTA）被认为是视觉逃避反应的重要信息中继站，但其神经元兴奋性的调控机制尚未明确。
中国科学院深圳先进技术研究院王立平教授团队在Neuron上发表题为“A bone-derived hormone permits rapid visual escape via GPR37 receptor in a subpopulation of VTA GABAergic neurons”的研究论文，首次揭示骨骼来源的激素骨钙素（osteocalcin,OCN）是快速视觉逃避行为的关键调控因子，其通过OCN-GPR37-cAMP-THIK-1（KCNK13）信号通路，增强VTA的y-氨基丁酸（GABA）能/谷氨酸能共释放神经元的兴奋性，从而为快速逃避行为建立“许可状态”。敲除OCN或G蛋白偶联受体37（GPR37）会显著延迟逃避反应，而恢复该通路功能可逆转行为缺陷。该研究揭示了骨—脑轴在生存防御行为中的重要作用，并为骨质疏松相关抑郁、神经退行性疾病等跨器官疾病提供了潜在治疗靶点。
中国科学院深圳先进技术研究院脑认知与脑疾病研究所/深港脑科学创新研究院王立平研究员为本文最后通讯作者，刘雪梅副研究员、谭力铭研究员、李翔研究员为本文共同通讯作者，刘雪梅副研究员、博士后王帅毓、助理研究员赖娟为论文共同第一作者。
骨钙素（OCN）作为骨骼来源的激素，可穿过血脑屏障，对急性应激反应至关重要。为探究其在视觉防御行为中的潜在作用，比较了3月龄（年轻）和14月龄（老年）野生型（WT）小鼠的循环未羧化OCN（Gla-OCN）水平及逼近性视觉刺激诱发的防御反应（图1A和1B）。老年小鼠的血清OCN水平显著低于年轻小鼠（图1C），且视觉逃避反应延迟（图1D），腹腔注射OCN可恢复其正常逃避行为（图1E）。逼近性视觉刺激可诱导循环OCN水平急性升高并持续至少30分钟，这表明OCN是逼近性视觉刺激诱导防御行为的关键介导因子（图1F）。
通过3D层级行为分析平台监测OCN敲除（KO）小鼠其自发行为，发现野生型和OCN敲除小鼠在中央区域停留时间、运动速度方面以及自发行为组成方面未出现变化。而在逼近性视觉刺激测试中，OCN⁻/⁻表现出与老年野生型小鼠相似的防御表型缺陷，GPR37⁻/⁻小鼠也出现逃避延迟，GPR158⁻/⁻小鼠无异常（图1G）。证实OCN主要通过GPR37介导防御反应。
图1 | OCN及其受体介导对逼近性视觉刺激的先天性防御反应
为验证VTA局部OCN信号是否能够挽救OCN敲除小鼠的防御行为缺陷，在OCN敲除小鼠的VTA局部施用OCN（图2A）。结果显示，该处理显著缩短了逃避反应潜伏期和返回巢穴时间，并增加了小鼠在巢穴中的停留时间（图2B和2C）。通过Lenti-GPR37-GFP在GPR37⁻/⁻小鼠的VTA恢复GPR37表达，可以重建快速逃避反应（图2D-2F）。相反，在GPR37⁻/⁻小鼠VTA局部施用OCN并不能挽救其防御行为缺陷（图2G-2H），说明在VTA OCN与GPR37的相互作用，对逼近视觉刺激诱发的逃避行为起到至关重要的作用。为验证OCN与VTA神经元中的GPR37是否存在物理结合，使用生物素化OCN进行免疫染色实验。结果显示OCN可直接结合VTA多巴胺能神经元（TH⁺）和GABA能神经元（GAD67⁺）上的GPR37。
图2 | VTA完整的OCN-GPR37信号通路是快速视觉逃避的关键
为确定介导OCN-GPR37信号的VTA神经元类型，分别在不同神经元群体中敲除GPR37。结果显示，无论是全身性还是VTA特异性在多巴胺能神经元中敲除GPR37，均不影响对逼近性视觉刺激的逃避反应（图3A-3D）。在GPR37flox/flox小鼠中分别注射AAV-CaMKIIα-Cre-GFP或AAV-Dlx5/6-Cre-GFP，选择性敲除VTA谷氨酸能神经元或GABA能神经元中的GPR37。结果显示两类神经元中GPR37的缺失均显著损害逼近性视觉刺激诱导的逃避反应（图3E-3H）。上述结果表明，OCN通过作用于VTA谷氨酸能和GABA能神经元中的GPR37，介导逼近性视觉刺激诱导的逃避行为。
图3 | VTA中GPR37的细胞类型特异性操控及其对视觉防御行为的影响
为探究OCN对VTA GABA能神经元的影响，在GAD2-ires-Cre小鼠VTA注射AAV-DIO-GFP，并进行全细胞膜片钳记录（图4A）。通过单峰-双峰检验，在OCN处理前，这些GABA神经元表现为单一群体；而在10 ng/mL OCN处理15 min后，则被分为两个功能亚群：I型和II型神经元（图4B）。证实OCN可特异性驱动VTA GABA能神经元分化为两个功能不同的亚群。电生理结果表明，基础条件下I型神经元的自发放电频率低于II型神经元；OCN处理后I型神经元自发性动作电位发放频率增加，而II型神经元降低（图4C-4E）。突触电流记录显示sEPSCs和sIPSCs无显著变化，提示该效应源于神经元内在特性改变。
进一步在GPR37⁻/⁻与GPR158⁻/⁻小鼠中注射AAV-Dlx5/6-GFP并进行膜片钳记录，探究它们是否与两种已知的OCN激活受体（GPR37和GPR158）相对应（图4F和4K），GPR158⁻/⁻小鼠输注OCN后，未检测到Ⅱ型（易受抑制型）神经元（图4G），且OCN降低静息膜电位（图4H和4I）、提高神经元兴奋性（图4J）。反之，GPR37⁻/⁻小鼠OCN处理后，无Ⅰ型（易受兴奋型）神经元（图4L），OCN对静息膜电位无影响（图4M和4N），但降低动作电位发放频率（图4O）。已有研究表明OCN可通过调控钾电流调节神经元兴奋性。向GAD2-ires-Cre小鼠注射AAV-DIO-GFP并记录（图4P），发现OCN输注后，神经元峰值及稳态钾电流均低于基线（图4Q和4R）。结果证实，OCN通过GPR37/GPR158将VTA GABA能神经元分为两个兴奋性亚群，并调控其钾离子电流。
图4 | OCN在VTA GABA能神经元的不同亚群中诱发兴奋性或抑制性反应
为探究GPR37在视觉逃避中的作用。对雄性小鼠的VTA组织进行单细胞核RNA测序（snRNA-seq），并通过均匀流形近似和投影（UMAP）及无监督聚类，构建VTA细胞类型图谱，根据Snap25的表达将细胞分为神经元和非神经元细胞。神经元根据经典标志物分为谷氨酸能（Glu）、γ-氨基丁酸能（GABA）、GABA-谷氨酸能（GABA-Glut）和多巴胺能（DA）四种类型（图5A和5B）。GABA-Glut神经元占所有神经元的一半以上，占表达GABA能或谷氨酸能标志物神经元的70%（图5B）。GPR158广泛高表达，而GPR37仅在多巴胺能和GABA能神经元（纯GABA能和GABA-谷氨酸能）中低水平表达，在纯谷氨酸能神经元中不表达（图5C和5D）。GPR37在GABA-谷氨酸能神经元亚型2中高表达，与钾通道基因Kcnk13（编码THIK-1）高度共表达；GPR158在亚型1中富集，与Kcnj3（编码GIRK1）共表达（图5E-5I）。原位测序揭示两种GAD2阳性细胞（GPR37+KCNK13+和GPR158+KCNJ3+）无明确空间分离，但分子表达特征不同（图5J-5N，和5O）。
图5 | snRNA-seq鉴定VTA不同神经元群体中GPR37、GPR158受体及其共表达的钾通道
为进一步证实OCN、钾通道和神经元兴奋性之间的受体依赖性关联，在GPR158⁻/⁻和GPR37⁻/⁻的VTA注射AAV-Dlx5/6-GFP。在GPR158⁻/⁻小鼠中，预先施用KCNK13抑制剂CVN293可单独使静息膜电位去极化，并增加一系列正向电流诱发的VTA GABA能神经元兴奋性，后续施用OCN无额外作用（图6A-6D）；电压钳记录显示OCN可显著抑制GPR158⁻/⁻小鼠VTA神经元的KCNK13电流（图6E-6H）；在GPR37⁻/⁻小鼠中，预先施用KCNJ3抑制剂TPN-Q可单独使静息膜电位去极化并提高神经元兴奋性，后续施用OCN无额外作用（图6I-6L）；OCN可增强GPR37⁻/⁻小鼠VTA神经元的KCNJ3电流（图6M-6P）。
腹腔注射KCNK13抑制剂CVN293（5 mg/kg）或向KCNK13flox/flox小鼠VTA注射AAV-Dlx5/6-Cre-GFP（对照组：AAV-Dlx5/6-GFP）特异性敲除GABA能神经元的KCNK13，均会导致野生型小鼠视觉逃避行为缺陷，证实KCNK13是OCN-GPR37通路的关键下游靶点（图6Q-6U）。
图6 | KCNK13和GIRK1通道在OCN介导的VTA神经元兴奋性及行为调控中的作用
单细胞转录组学和电生理学证据均表明，编码K2P13.1（THIK-1）通道的Kcnk13是OCN-GPR37信号的下游靶点。已有研究显示，GPR37激活会导致环磷酸腺苷（cAMP）减少。为探究cAMP是否参与逼近性视觉刺激诱导的视觉逃避，向GAD-Cre小鼠VTA注射AAV-DIO-GFlamp2和AAV-DIO-FRCaMPi（图7A和7B）。当这些小鼠受到逼近性视觉刺激时，观察到VTA GABA能神经元的cAMP探针荧光强度显著降低，同时钙离子荧光强度增加（图7C和7D）。在OCN敲除小鼠VTA注射AAV-Dlx5/6-GFlamp2和AAV-Dlx5/6-FRCaMPi并受到逼近性视觉刺激时，未观察到cAMP或钙离子荧光的变化（图7E-7H）。
为进一步明确GPR37与OCN介导的cAMP调控的关联，对比了GPR37敲除（GPR37⁻/⁻）小鼠与野生型小鼠VTA GABA能神经元的基线cAMP水平。发现GPR37⁻/⁻小鼠的基线cAMP水平显著升高（图7A-7H）。当向该脑区注射cAMP阻滞剂3'-磷酸腺苷-5'-磷酸硫酸盐（PAPS）后，可以恢复其对逼近视觉威胁的逃避行为，说明降低cAMP对快速逃避反应至关重要（图7K）。机制上，OCN激活GPR37通过非经典Gi通路降低cAMP水平，从而抑制KCNK13（K2P13.1）通道，提高VTA GABA神经元的兴奋性，最终促进面对视觉威胁时的快速逃避行为（图7L），凸显GPR37在cAMP信号和神经元兴奋性调控中的重要作用。
图7 | GPR37介导VTA区cAMP降低，是快速视觉逃避的关键
本研究揭示了一种意想不到的机制：骨骼来源的OCN通过激活VTA GABA能神经元亚群中的GPR37受体，介导快速视觉逃避。OCN-GPR37信号通过非经典通路抑制THIK-1通道，从而增强神经元兴奋性。这些发现突显了OCN在调节VTA环路以实现生存关键行为中的作用，揭示了脑-体通信的新轴。
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