客户文章丨Nat. Neurosci.丨华科大朱铃强/刘丹/鲁友明团队揭示脊髓病理是AD患者触觉缺陷与认知下降的关键诱因

研究人员对216名≥65岁参与者（健康对照组HC 93人、轻度认知障碍组MCI 97人、阿尔茨海默病组AD 26人）进行触觉检测，依据蒙特利尔认知评估（MoCA）评分分组（HC 25-30分、MCI 19-24分、AD 0-18分），采用冯・弗雷（Von Frey）刺激前臂，测试无害（0.4g、0.6g）及有害（2.0g、4.0g）机械刺激敏感性（图1a）。结果显示，MCI与AD患者对无害刺激的响应率显著降低，触觉阈值高于HC组，且阈值与MoCA评分呈负相关（图1b-d）；但三组对有害刺激的响应无显著差异，视觉模拟评分（VAS，用于评估疼痛强度）与刺激力度正相关（图1e-g）。小腿部位检测结果一致，触觉异常比例为：MCI患者前臂63.9%、小腿66.3%，AD患者前臂73.1%、小腿82.4%，证实MCI与AD患者触觉损伤但痛觉正常。

随后通过行为学实验检测3×Tg转基因AD小鼠（携带APPswe/PSEN1-M146V和MAPT-P301L突变）的轻触觉功能（图1h）。粘性胶带测试中，2-7月龄3×Tg小鼠对背部胶带的响应次数（啃咬、抓挠、抖毛）显著少于野生型（WT）小鼠（图1i）；Von Frey刺激足底、轻刷无毛皮肤的测试中，3×Tg小鼠对无害刺激的敏感性持续降低（图1j-k）。3月龄时，68.4%的3×Tg小鼠在三项触觉测试中均异常（图1l），且此时未出现认知障碍及AD相关病理（4月龄后才出现），故选用3月龄小鼠进行后续实验。此外，3×Tg小鼠对有害机械刺激、急性化学性瘙痒、热/冷刺激、急性化学性疼痛的响应均正常，运动协调能力与WT小鼠相当，表明其仅轻触觉感知下降。

图1 早期AD患者及模型小鼠的触觉缺陷

脊髓是轻触觉信号整合传递至大脑的核心中转站。AD患者脊髓中已发现Aβ沉积与Tau病理共存，首先明确二者在AD早期触觉缺陷中的作用。3×Tg小鼠脊髓前/后角T231、S262等位点Tau磷酸化水平升高，与AD患者脊髓Tau过度磷酸化一致（图2a-b），荟萃分析证实脊髓Tau病理与AD强相关。抗TOC1抗体（一种可特异性识别Tau二聚体及更高阶寡聚体的单克隆抗体）免疫染色显示，AD患者及PS19小鼠（Tau-P301S突变型）脊髓背角III-IV层存在异常Tau聚集（图2c-d），AD患者样本TOC1免疫反应性及Tau聚集水平显著高于其他神经系统疾病（OND）患者（图2e-f）。Tau病理仅局限于脊髓神经元（小胶质细胞/星形胶质细胞无），大脑认知区、皮质脊髓投射通路及外周传入神经中均未检测到，且3×Tg/PS19小鼠脊髓Aβ42、Aβ40及寡聚化Aβ水平与WT小鼠无差异，提示AD早期触觉缺陷由Tau病理而非Aβ沉积导致。

进一步在三种小鼠模型验证：仅含Tau病理的PS19、rTg4510小鼠（Tau-P301L突变型）出现多毛/无毛皮肤触觉脱敏，仅含Aβ沉积的APP/PS1小鼠（APP695swe/PS1-dE9突变型）触觉正常；PS19、rTg4510小鼠脊髓后角存在Tau病理，APP/PS1小鼠无（图2d、g-j），且所有小鼠的痛觉、瘙痒感知及运动协调能力均正常。PS19小鼠定量分析显示脊髓全段Tau磷酸化（T231、S262等）及总Tau水平升高（图2g-j），通过加权公式定量Tau病理（pTau）值，与粘性胶带、Von Frey及动态触觉测试结果呈负相关（图2k-n），证实脊髓Tau病理是AD模型小鼠触觉异常的关键诱因。

图2 PS19小鼠脊髓中Tau蛋白病理改变与触觉缺陷相关

为了探究Tau病理损害触觉的机制，研究对PS19小鼠与WT小鼠腰段脊髓（L1-L4）背角进行单核RNA测序（snRNA-seq），识别出8种谷氨酸能神经元、7种GABAergic神经元及7种非神经元细胞，两类小鼠细胞比例无差异（图3a）。借助AUCell工具计算神经原纤维缠结（NFT）相关基因（NRG）转录组变化，发现神经元NRG表达高于非神经元细胞（图3b），且PS19小鼠中NRG异常在CCK、PKCγ（Prkcg编码）、Meis2表达神经元中最显著（图3b-c），其他神经元（如PKCγ）呈分散异常。PS19小鼠与AD患者的CCK神经元中，T231、S262位点及AT8（pS202/pT205）位点Tau过度磷酸化水平显著高于其他神经元（图3d），且该Tau病理富集于脊髓背角IIiv-IV层（无害触觉信号整合传递关键区）（图3e）。c-FOS标记显示，PS19小鼠该层神经元在触觉测试中活性降低（图3f-i），且CCK神经元等6类神经元的活性调节基因（ARG）表达下调最显著（图3j），但暂无法确定CCK神经元中Tau病理是NRG异常与ARG下调的直接原因。

图3 Tau病理学使AD中脊髓CCK神经元失活

为了观察自由活动小鼠脊髓CCK神经元活性，研究将CCK-Cre与PS19小鼠杂交获得PS19;CCK-Cre小鼠，向其与CCK-Cre小鼠脊髓后角注射rAAV9-hSyn-DIO-jGCaMP8s病毒，使钙指示剂jGCaMP8s特异性表达于CCK神经元。钙成像显示，CCK神经元可被Von Frey刺激激活（图4a-b）。随后向PS19;CCK-Cre小鼠脊髓背角双侧注射rAAV2/9-hSyn-DIO-sihTau-mCherry（siTau，Tau沉默病毒）或对照病毒mCherry（图4c），结果显示沉默Tau可完全恢复其粘性胶带、Von Frey及动态触觉测试表现（图4d-f）。电生理记录证实，siTau小鼠CCK神经元的自发兴奋性突触后电流（sEPSC）振幅与频率均较对照小鼠恢复（图4g-k），符合突触前囊泡释放及突触后结构修复特征，且其他感觉模态不受影响。上述数据表明，脊髓后角CCK神经元因Tau病理失活是AD触觉功能障碍的诱因之一。综上，特异性抑制脊髓CCK神经元中的Tau病理，或为恢复AD患者触觉感知及突触功能的潜在策略。

图4 沉默CCK 神经元中Tau可恢复AD的触觉

针对PS19小鼠脊髓CCK神经元活性降低的现象，研究向PS19;CCK-Cre小鼠脊髓双侧注射Cre依赖型rAAV2/9-hSyn-DIO-hM3D(Gq)-eGFP病毒，使hM3D(Gq)特异性表达于CCK神经元（图5a）。给予CNO激活该神经元后，小鼠触觉响应部分改善（图5b-i），且不影响其他感觉及运动功能（图5j-s）。

图5 化学遗传学激活CCK神经元可逆转了AD小鼠的触觉损伤

为了探究机制，分析snRNA-seq数据发现CCK神经元中多个活性及突触相关基因异常，通过Python单细胞调控网络推断与聚类（pySCENIC）流程筛选出10个关键调控子（图6a-c），其中c-Maf因以下特性成为核心靶点：（1）参与感觉神经元及脊髓背角III/IV层神经元发育；（2）调控子在CCK神经元中高度富集；（3）PS19小鼠与AD患者脊髓背角IIiv-IV层CCK神经元中c-Maf表达升高（图6d）；（4）与pTau水平正相关（图6e）；（5）调控皮质网络兴奋性。进一步证实，c-Maf转录调控Dlg2、Nrn1等活性相关基因，而这些基因在PS19小鼠脊髓CCK神经元中存在异常表达（图6f-h），且Tau病理可调控c-Maf及其下游靶标表达。为了进一步明确c-Maf在AD小鼠触觉缺陷中的关键作用，向PS19;CCK-Cre小鼠注射靶向c-Maf的dCas9-KRAB/sgRNA慢病毒（图6i），可恢复其触觉测试表现（图6j-l）及CCK神经元sEPSC振幅与频率（图6m-q），且不影响其他感觉及运动。综上，抑制脊髓后角CCK神经元中的c-Maf可恢复触觉感知与突触功能，证实其在Tau病理诱导的AD触觉缺陷中起关键作用。

图6 CCK神经元中c-Maf调控子介导Tau病理学诱导的触觉缺陷

已证实脊髓CCK神经元中Tau病理及Maf转录诱发触觉缺陷，研究进一步探究其与AD进展的关联：3月龄3×Tg小鼠按触觉表现分为正常组（NRM）和异常组（ABN）（图1l），6月龄时ABN组在莫里斯水迷宫和巴恩斯迷宫测试中认知表现更差（图7a-d），旷场与高架十字迷宫行为无差异；且ABN组海马区树突棘密度降低、Tau病理更重、Aβ斑块更多（图7e-g），证实触觉缺陷与AD进展密切相关。

为了验证早期干预触觉损伤的作用，将CCK-Cre与3×Tg小鼠杂交获得3×Tg;CCK-Cre小鼠，3月龄时向脊髓CCK神经元注射siTau病毒，结果显示其粘性胶带、Von Frey及动态触觉测试响应完全恢复（图7h-j），6月龄时莫里斯水迷宫和巴恩斯迷宫表现更优（图7k-n），12月龄时海马区树突棘密度升高、pTau强度降低、Aβ斑块减少（图7o-q）。感染c-Maf沉默病毒（sgc-Maf）的CCK-AD小鼠也呈现类似改善效果（图7r-aa）。构建更接近生理的模型，向3月龄Mapt（编码Tau蛋白的基因）敲除的CCK-Cre小鼠脊髓注射含人源野生型Tau（1N4R亚型，模拟Tau病理沉积）的AAV，2个月后出现触觉异常，3个月后出现学习记忆缺陷；相同模型过表达c-Maf也出现类似效应。综上，特异性沉默脊髓CCK神经元中的Tau或c-Maf干预触觉缺陷，可有效延缓AD进展。

图7 沉默CCK神经元中Tau或c-Maf可延缓AD的进展

AD中，脊髓CCK神经元的Tau病理通过异常激活c-Maf，抑制神经元活性和突触传递，进而导致触觉缺陷和认知障碍，形成“外周感官损伤-中枢认知障碍”的关联通路。触觉阈值可作为AD认知障碍进展的无创生物标志物，其与MoCA评分的高相关性为临床早期筛查提供依据。靶向脊髓CCK神经元中的 Tau或c-Maf，可同时改善触觉缺陷和认知障碍，为AD治疗提供了“外周干预中枢”的新策略，避免直接作用于大脑可能的副作用。