现有乳酸探针检测工具可体内检测，但空间分辨率低（无法单细胞水平）且有创（破坏组织）。绿色荧光传感器（如eLACCO2.1）虽实现微创成像，但光谱与GCaMP钙离子传感器重叠，无法多标监测乳酸与神经活动。
2025年发表于《Nature Communications》的研究文章“A red fluorescent genetically encoded biosensor for in vivo imaging of extracellular L-lactate dynamics”，开发出红色荧光基因编码的细胞外L-乳酸探针R-eLACCO2.1，其通过定向进化优化（从R-eLACCO0.1经多轮进化获得，含25个突变）及Igκ leader与COBRA anchor的膜定位优化，在体内对细胞外L-乳酸升高的敏感性和光谱正交性上优于此前绿色荧光探针。
研究人员先通过将绿色探针eLACCO1的环形排列绿色荧光蛋白（cpGFP）替换为环形排列红色荧光蛋白（cpmApple），构建出红色荧光L-乳酸探针原型R-eLACCO0.1（ΔF/F=0.2），随后经定向进化获得ΔF/F=4.3的R-eLACCO1，引入Leu79Ile突变得到低亲和力变体R-eLACCO1.1（ΔF/F=3.9，Kd=1.4 mM），但该变体细胞表面表达荧光暗淡、响应有限（ΔF/F≈1）；进而以R-eLACCO1为模板，经1轮定点优化和11轮全基因随机突变定向进化得到ΔF/F=18的R-eLACCO1.93，引入Ile191Val突变后获得含25个突变的高度优化变体R-eLACCO2，表征发现其变体可作荧光寿命成像显微镜(FLIM，通过监测探针分子的“荧光寿命（τ）变化”实现检测，荧光寿命是荧光分子的固有属性，不受浓度、激发功率等外界因素影响)探针，冷冻电镜解析其2.7Å乳酸结合态结构，揭示发色团与Lys211的静电相互作用及Lys211对荧光的关键调节作用。在细胞表面定位优化上，基于此前eLACCO2.1研究经验，筛选发现GPI类锚定结构域（如CD59、COBRA、GFRA1）能实现低亲和力变体R-eLACCO2.1高效膜定位，14种N端引导序列中HA、Igκ、pat-3荧光最强，进一步组合筛选得出Igκ引导序列+COBRA锚定结构域为最佳组合，该组合下R-eLACCO2.1的ΔF/F约为5，是R-eLACCO1.1（CD59引导-锚定组合）的5倍。
图1 L-乳酸探针细胞表面定位优化概述
对带优化引导序列（Igκ）和锚定结构域（COBRA）的R-eLACCO2变体进行表征（图2a），HeLa细胞表面表达的R-eLACCO2、R-eLACCO2.1经10 mM L-乳酸处理后，ΔF/F分别为4.5±0.1、6.2±0.2（图2b-c）；对照R-deLACCOctrl膜定位正常，但对L-乳酸无响应（图2a-d）。二者对L-乳酸的原位表观Kd分别为560 μM、5.1 mM（图2d），对Ca²+的原位表观Kd为310 μM、610 μM（图2e），均低于脑内胞外Ca²+浓度；结合速率（τon）均为61±5 s/61±3 s，解离速率（τoff）为72±4 s/35±3 s（图2f）。基于cpmApple的探针蓝光下易光激活且光稳定性复杂，HeLa细胞中R-eLACCO变体经470 nm蓝光（~4 mW/cm²）照射，荧光轻微升高（图2g），其光激活ΔF/F远小于乳酸响应，动力学更快（图2c-f）。无乳酸时，R-eLACCO2、R-eLACCO2.1的积分荧光（IF，量化荧光信号的整体强度与稳定性）为1251±18、1485±32，高于mApple；有乳酸时，两者的光稳定性有所下降，IF降至702±5、731±9（图2h）；R-deLACCOctrl光稳定性始终高于mApple。
图2 活体哺乳动物细胞中R-eLACCO2变体的表征
观察L-乳酸时空动态，饥饿胶质母细胞瘤细胞（T98G）共表达R-eLACCO2.1（胞外）与iLACCO1（胞内）（图3i），葡萄糖刺激后二者荧光同步升高（图3j-k），R-deLACCOctrl荧光下降（推测因乳酸升高伴随pH降低，图3k）。HeLa细胞中R-eLACCO2与笼状L-乳酸（MNI-L-乳酸，紫光照射下会释放L-乳酸）共孵育，405 nm光照射后，R-eLACCO2荧光先降（质子释放致pH降低）后升（图3m-n），R-deLACCOctrl仅短暂下降无后续响应，表明其可与绿色荧光探针、紫光激活工具联用。FLIM检测中，HeLa细胞表面的R-eLACCO2、R-eLACCO2.1经10 mM L-乳酸处理，两者的荧光寿命显著延长（图3o-p）。胶质母细胞瘤细胞（T98G）共表达R-eLACCO2.1与LiLac（胞内乳酸FLIM探针），葡萄糖刺激后R-eLACCO2.1荧光寿命如预期升高，LiLac如预期降低（图3q-s），证明其可作为FLIM探针检测活细胞胞外L-乳酸。
图3 用R-eLACCO2变体直接观测L-乳酸的时空动态变化
为了表征R-eLACCO变体在神经元表面性能，将其构建于神经元特异性启动子hSyn调控表达的质粒中并转染大鼠原代皮质神经元，表达R-eLACCO2的神经元呈明亮膜定位荧光（图4a）；浴槽加10 mM L-乳酸后，R-eLACCO2、R-eLACCO2.1的ΔF/F分别为4.3±0.3、4.5±0.2，R-deLACCOctrl无响应（图4b-c）。将探针构建到星形胶质细胞特异性启动子gfaABC1D调控表达的质粒，在大鼠原代皮质星形胶质细胞表面可正确表达（图4d）；浴槽加10 mM L-乳酸后，R-eLACCO2、R-eLACCO2.1的ΔF/F分别为4.7±0.4、3.9±0.4（图4e-f），R-deLACCOctrl无响应。
为了验证R-eLACCO2.1检测完整组织乳酸的能力，对AAV介导表达该探针的小鼠脑SCN切片进行检测（图4g），虽然培养基15 mM葡萄糖可能升高基础胞外乳酸，但浴槽加乳酸后，R-eLACCO2.1荧光显著高于R-deLACCOctrl（图4h-j）。综上，带优化引导序列与锚定结构域的R-eLACCO变体，可用于培养神经元、星形胶质细胞表面及脑切片中细胞外L-乳酸的成像检测。
图4 R-eLACCO2变体在脑细胞与脑组织中的验证
为了验证R-eLACCO2.1体内性能，研究人员向成年小鼠注射编码hSyn-R-eLACCO2.1的AAV，使其在vS1皮层表达（图5a）。已知静脉注射的L-乳酸可穿过血脑屏障，向清醒小鼠尾静脉注射后，通过双光子激光扫描显微镜（AO2P）观察到，100 μm和400 μm深度处R-eLACCO2.1荧光显著升高（图5b）。为了进一步证实其监测胞外L-乳酸动态的能力，研究人员同步记录R-eLACCO2.1荧光信号与体外校准后植入vS1的电化学（EC）L-乳酸探针电信号（图5c-d），结果显示二者信号均随乳酸浓度变化而增减；生理盐水注射会引发R-eLACCO2.1微弱荧光响应，原因未明（图5d）。成像表明，R-eLACCO2.1与EC探针信号高度相关（图5e），证实其胞外L-乳酸探针功能。活体成像中，静脉注射L-乳酸后，R-eLACCO2.1的荧光响应高于GFP基探针eLACCO2.1（图5f）。综上，R-eLACCO2.1作为胞外L-乳酸探针，在体内功能良好。
图5 R-eLACCO2.1在清醒小鼠中的验证
为了监测清醒小鼠内源性胞外L-乳酸动态，研究人员在其vS1皮层神经元表达R-eLACCO2.1，记录荧光响应与气流触须刺激下的运动速度（图6a）。vS1皮层Ⅱ/Ⅲ层神经元中，触须刺激既使R-eLACCO2.1荧光升高，也诱导小鼠运动（图6b）；长期成像显示该探针荧光稳定，证明荧光变化由乳酸浓度驱动，非光漂白。小鼠30秒静息后自发运动，R-eLACCO2.1荧光升高幅度与20秒触须刺激时相当（图6c），提示触须刺激下的荧光响应主要源于运动；未诱导运动的触须刺激仅引发微弱荧光响应。需注意，触须刺激诱导血管舒张与功能性充血，因激发光、发射光吸收增加导致探针实测荧光降低（图6b-c）。体内成像还证实，R-eLACCO2.1可检测运动后静息期胞外乳酸降至基础水平的过程，表明其能以细胞分辨率检测清醒小鼠内源性胞外L-乳酸动态。
最后，研究人员通过多通道AO2P成像探究清醒小鼠神经活动与代谢关联，向FLEX-GCaMP6f的转基因小鼠注射含hSyn-R-eLACCO2.1与hSyn-cre的AAV混合物（图6d）。单光子宽场成像与AO2P成像显示，vS1区域Ⅱ/Ⅲ层神经元中，R-eLACCO2.1定位于细胞膜，GCaMP6f定位于胞体（除细胞核），证实体内表达定位（图6e）。无明显运动时，自发神经激活后胞外乳酸先降后恢复（图6f-g）。综上，R-eLACCO2.1可同步监测清醒小鼠内源性胞外L-乳酸动态与神经活动。
图6 神经活动期间体内L-乳酸动态变化
R-eLACCO2.1探针红色荧光可与绿色指示剂（如GCaMP）同时使用，实现“乳酸-神经活动” 多标成像；体内对乳酸升高的响应优于绿色探针，且能检测基线以下的乳酸下降，兼具荧光强度成像与FLIM功能。
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