全球首个红色荧光钾探针RGEPO1/2来了！解析神经疾病新工具，北大李毓龙团队专业点评揭秘技术局限与未来方向

时间：2025-11-06 16:24:18

离子的稳态平衡与动态变化对神经元信号传递、细胞稳态维持等多种生物活动至关重要。在生理条件下检测这些离子变化是阐明其在健康维持与疾病发生中功能机制的核心前提。传统检测手段因侵入性强、分辨率低等局限难以满足研究需求。基因编码钾离子指示剂（GEPOs）提供了一种有前景的替代方案，可实现以最小的侵入性、高空间和时间分辨率实时监测离子浓度变化。

基于钙和钾离子的指示剂大多是绿色的，红色指示剂不仅具有光毒性低、更深的组织穿透力，还能与其他颜色指示剂联用实现多重成像。然而，已报道红色荧光钙指示剂灵敏性等性能仍不理想。2025年2月2日，西湖大学Kiryl D.Piatkevich团队在PLOS Biology上发表了题为“A Sensitive Soma-localized Red Fluorescent Calcium Indicator for Multi-Modality Imaging of Neuronal Populations In Vivo”的研究，开发出两种改进的钙指示剂FRCaMPi以及胞体定位版SomaFRCaMPi，其中SomaFRCaMPi已可与性能最优的绿色胞体定位GECI相媲美。

相较于红色钙指示剂，红色钾离子指示剂开发尚未获得突破。2025年9月17日，西湖实验室Kiryl D.Piatkevich团队与韦恩州立大学AliceR.Walker团队在PLOS Biology杂志上发表题为Sensitive red fluorescent indicators for real-time visualization of potassium ion dynamics in vivo的文章。该研究通过在大肠杆菌中定向进化并在哺乳动物细胞中优化，开发出了两种红色基因编码钾离子指示剂RGEPO1和RGEPO2，首次实现了小鼠癫痫发作期间细胞内外钾离子瞬变的可视化，为理解钾离子在神经活动与疾病中的作用提供了全新工具。

视频1. 在清醒小鼠海人酸（KA）诱导的癫痫发作期间，对初级躯体感觉皮层第2/3层，表达GCaMP6f与RGEPO1的神经元的单平面双色成像。

视频2. 在清醒小鼠海人酸（KA）诱导的癫痫发作期间，对初级躯体感觉皮层第2/3层，表达GCaMP6f与RGEPO2的神经元的单平面双色成像。

红色荧光钾指示剂的开发与验证

为开发基于单个红色荧光蛋白的钾离子指示剂，研究以已知的K⁺结合蛋白Hv-Kbp为模板，通过基因组挖掘技术，利用NCBI BLAST筛选出5种与Hv-Kbp同源且含保守钾离子结合位点的候选蛋白。将KRaION1指示剂中的Ec-Kbp替换为上述同源蛋白并在大肠杆菌中表达验证（图1a），综合亮度与响应幅度，最终选取Hv-Kbp嵌入红色FPmApple中形成初始传感器原型（图1b-d）。通过大肠杆菌高通量筛选，对Hv-Kbp嵌合体进行随机突变、优化链接肽长度及序列，获得ΔF/F超600%的最大变体（图1e）。指示剂在体外溶液中的性能无法直接迁移到哺乳动物细胞，研究发现最优变体在HEK293FT细胞中的ΔF/F仅为溶液中的1/13，推测细胞内环境会影响蛋白质结构及探针对钾离子的反应（图2ab）。

图1在大肠杆菌中红色钾离子探针的优化

为解决细胞内环境对探针性能的影响，将RGEPO0.5与不同天然蛋白质N端前导序列及PDGFRβ跨膜结构域融合实现靶向到细胞外表面，这有助于快速缓冲液交换从而提高筛选效率，结果发现天冬氨酸前导肽变体表现最优（图2c-e）。利用天冬氨酸-PDGFRβ细胞表面表达系统，进一步对探针连接区进行饱和突变，分别筛选出胞外响应值最高的RGEPO1与胞质响应值最高的RGEPO2，主要区别在于连接区的不同（图2f）。

在HEK293FT细胞中滴定检测显示，RGEPO1定位于细胞膜，对胞外钾离子敏感，EC₅₀为2.4±0.3mM，可检测范围0.5~20mM的钾离子变化（图2g-i）；RGEPO2分布于胞质和细胞核，对胞内钾离子响应，EC₅₀为43.3±6.3mM，可检测范围4-200mM的钾离子变化，且二者均具荧光可逆性（图2j-l）。这两种红色指示剂均基于新的Hv-Kbp结构域开发，经筛选优化可检测0.5-200mM范围的细胞内外钾离子动态。

图2 HEK细胞中的优化过程

RGEPOs在溶液中的表征

为评估RGEPOs在哺乳动物系统中的适用性，研究在哺乳动物细胞钾离子生理浓度范围（0-150mM，pH7.4）内对RGEPO1和RGEPO2的光谱表征显示，二者在无钾时呈双吸光度峰（448/446nm（质子化）和576/578nm（去质子化）），加钾后去质子化峰增强、质子化峰减弱，激发峰为575/574nm，发射峰为591/593nm，荧光强度分别增加4.7倍（RGEPO1）和3.1倍（RGEPO2）（图3ab）。这源于有效消光系数与量子产率增加，且二者在双光子激发下表现出钾依赖性荧光，适配体内成像需求。进一步验证RGEPOs的pH敏感性与离子选择性，二者在pH 6.5-9.0范围内对K⁺有显著荧光响应变化，RGEPO1、RGEPO2分别在pH8.0、7.4时动态范围最大（图3cd）；对多种金属离子的测试显示，仅K⁺能引发最高ΔF/F（RGEPO1为844%、RGEPO2为584%），且对Ca²⁺无响应，证实其K⁺选择性（图3e）。动力学测试中，RGEPO1、RGEPO2与钾离子结合达到平台期（最大荧光值）所需时长的一半对应的时间分别约3.66秒和8.11秒（图3gh），二者等渗条件下EC50分别为14mM和59mM（图3f），动态范围约0.1-225mM。综上，对其荧光光谱、亮度等特性的表征表明，RGEPO1和RGEPO2在不同生理环境中对钾离子均表现出高选择性与灵敏响应，是监测钾离子动态的理想指示剂。

图3 RGEPOs的体外特性表征

RGEPOs对钾离子敏感性的分子机制

RGEPO1的分子动力学模拟显示其存在主结合和瞬时结合两个钾离子结合口袋，主结合口袋由13个氨基酸组成，包括直接配位钾离子的D294和D350，以及通过与D294形成氢键稳定钾离子的R374（图4a），其表面从主结合位点到瞬时位点有连续电负性区域，有利于带正电离子结合与长时间保留（图4c）。RGEPO2仅一个结合口袋，由7个氨基酸组成，位于靠近荧光蛋白的位置，钾离子结合时，发色团酚盐基团与K317形成氢键系列作用，引发荧光信号改变（图4b），且其口袋周围存在电负性残基聚集，有助于阳离子的稳定结合（图4c）。分子动力学证实两者荧光传感机制相同，均为钾离子结合主结合口袋后与发色团酚盐环的O-位置形成氢键相互作用，不同的是RGEPO1的相互作用需溶剂介导，RGEPO2则无需（图4d）。综合表明，两者的主要结合口袋更可能与荧光机制相关。

图4 RGEPOs对钾离子敏感性的分子机制

RGEPOs记录原代神经元和星形胶质细胞的钾离子的动态变化

在原代海马神经元质膜外侧表达RGEPO1、胞内表达GCaMP6f（图5a），经30mM钾离子刺激后，荧光分别增约71%、350%，峰值时间为27秒和3秒，冲洗后恢复基线（图5b）。已知谷氨酸对谷氨酸受体的过度刺激会导致神经元钾离子大量流出，在相同的海马神经元中共表达RGEPO2（RGEPO2在神经元胞体和树突中均匀分布）和GCaMP6f，经500µM谷氨酸刺激后，GCaMP6f荧光增强约1076%，峰值时间为9s，而RGEPO2荧光减弱约48%，峰值时间为72s（图5d）。这表明RGEPOs可监测神经元内外钾离子瞬时动态。

与神经元相比，星形胶质细胞对于调节和维持稳定的细胞外钾水平至关重要，确保中枢神经系统的整体稳态。在原代小鼠星形胶质细胞中，RGEPO1荧光随胞外钾离子浓度升高而增强，50mM时ΔF/F达206%，表面解离常数4.4±1.1mM；胞内RGEPO2荧光也依赖钾离子浓度，200mM时ΔF/F达328%，EC50约50±6.9mM（图5g-l）。这些结果表明，胞外钾离子升高会触发星形胶质细胞摄取钾离子，支持其钾离子空间缓冲作用。在类似的去极化条件下，神经元表现出对钾的不同反应。

图5 RGEPOs记录原代神经元和星形胶质细胞中钾离子的动态变化

RGEPOs记录急性脑切片中神经元的钾离子瞬态变化

研究借助重组腺相关病毒（rAAV）在新生小鼠大脑皮层神经元中共表达RGEPO1或RGEPO2与GCaMP6f，感染3-4周后，通过免疫组化验证RGEPOs在皮层区域的表达效果（图a-c）；表达6周后，制备急性脑切片。结果发现在20/30mMKCl刺激下，RGEPO1荧光增加6.5%、RGEPO2降低7.0%，GCaMP6f分别增加104%和128%，且冲洗后均恢复基线（图6d-i）。尽管急性脑切片中钾离子检测的ΔF/F值比培养神经元小，可能因蛋白质表达和组织调控网络差异，但整体趋势一致，证明RGEPO能有效检测完整脑组织中细胞内外的钾离子动力学。

图6 RGEPOs记录急性脑切片中神经元的钾离子瞬态变化

RGEPOs记录小鼠癫痫发作期间钾离子的动态变化

癫痫是一种严重的神经系统疾病，其特征是钾离子通道缺陷和钾离子稳态失调，导致大脑过度兴奋和癫痫发作。研究团队在初级体感皮层的神经元中共表达GCaMP6f与RGEPOs，采用双光子显微镜观察由红藻氨酸诱导癫痫发作时L2/3神经元活动（图7ab）。与先前研究一致，钙信号记录中观察到同步荧光波及后续全域传播荧光波，分别对应癫痫发作活动期与去极化扩散波期（图7c-e）。RGEPO1在癫痫终止后出现荧光增强扩散波（中值峰值ΔF/F=89%），与GCaMP6f波空间一致但其波前更宽（图7cdg），这可能源于RGEPO1比GCaMP6f更慢的动力学特性，导致更平缓的响应；RGEPO2在癫痫发作时荧光快速衰减（中值峰值ΔF/F=-52%），与GCaMP6f同步且后续出现传播波，检测到细胞内钾离子水平降低（图7efh）。这些结果表明尽管RGEPOs动力学较慢，但RGEPO1和RGEPO2可在小鼠体内癫痫发作期间可靠报告钾离子浓度变化，首次实现药物诱导癫痫发作中群体水平的单细胞分辨率钾离子动力学观察，且与钙指示剂GCaMP6f兼容。

图7 红藻氨酸诱发癫痫小鼠模型中GCaMP6f与RGEPOs的双光子成像

总结

RGEPOs是首个红色基因编码的钾离子指示剂，可实现多种生物系统胞内外钾离子动态的实时可视化，包括细胞培养、脑切片以及活体动物。虽然RGEPOs在时间和信号幅度分辨率上不如GCaMP6f等钙离子指示剂，但这一研究为理解钾离子在生理和病理过程中的作用提供了新工具，也为进一步开发基于红色荧光蛋白的生物传感器开辟了新的道路。

专家点评

北京大学生命科学学院李毓龙

西湖大学Kiryl D.Piatkevich团队的这两项研究为红移离子成像领域带来重要突破，不仅开发出性能优化的钙指示剂（FRCaMPi与SomaFRCaMPi），更首次成功研发红色钾指示剂（RGEPO1与RGEPO2），大幅扩充了用于探测大脑及其他组织细胞活动的成像工具库。这些红色指示剂凭借深层组织穿透、多通道监测及低侵入性优势，为解析不同生物系统的神经动态与离子信号传导提供了全新技术路径。

这类红色指示剂可与绿色荧光指示剂高效联用，实现钙/钾离子动态变化与神经递质、神经调质信号的同步成像。这种技术组合可实现同时追踪神经元活动与神经化学事件（如小分子神经递质、神经肽释放），在生理或病理条件下对活体动物进行监测，进而为揭示不同脑区的神经调节机制提供关键数据支撑。

目前该技术仍存在一个关键局限：以mApple为骨架的指示剂（如 jRGECO1a）易受蓝光诱导产生光激活效应。这限制了其与蓝光驱动光遗传学工具的联用效果。因此，未来研究需着力降低光激活敏感性，同时持续提升指示剂的光稳定性、离子选择性与动态范围，实现在复杂实验环境中充分发挥其应用潜力。