一篇看懂自噬研究的 “病毒利器”，自噬机制 + 病毒工具原理，附文献案例详解！

自噬（autophagy）是真核细胞内一种高度保守的降解与再循环的生理过程，由比利时科学家Duve于1963年首次提出。核心功能是通过降解细胞内受损的细胞器、错误折叠的蛋白质或入侵的病原体，将降解产物（如氨基酸、脂肪酸、核苷酸）重新回收利用，以维持细胞内环境稳态、应对外界压力（如营养匮乏、氧化应激）。它被形象地称为细胞的 “垃圾处理厂” 和 “应急粮仓”，对细胞生存、发育及疾病发生发展具有关键意义。

根据降解物质的性质、包裹方式及参与机制的差异，细胞自噬可分为3类：

• 巨自噬(macroautophagy)：是研究最广泛、最主要的类型。通过形成双层膜结构的细胞自噬体（autophagosome）包裹受损细胞器（如异常线粒体）、大的错误折叠的蛋白聚集体等，随后自噬体与溶酶体融合形成自噬溶酶体，将自噬体膜及包裹的物质彻底降解。

• 微自噬(microautophagy)：无需自噬体。溶酶体膜直接向内凹陷、折叠，包裹小分子蛋白质或小细胞器碎片 通过溶酶体酶直接降解。因溶酶体膜凹陷能力有限，它只处理小分子或小碎片。

• 分子伴侣蛋白介导的自噬(chaperone-mediated autophagy, CMA)：一种高度特异性的自噬。特定的分子伴侣蛋白（如Hsc70）能识别带有特定氨基酸序列（KFERQ样序列）的蛋白质，并将其直接“护送”到溶酶体膜上进行转运和降解。不形成自噬体。

图1 三种自噬途径图^[1]。

细胞自噬的核心是细胞内的膜重排，通过这一过程先形成包裹随机或特定底物的双层膜封闭囊泡（自噬体），再与溶酶体融合为自噬溶酶体，最终实现底物的降解。细胞自噬的发生过程大体分为以下4个阶段：

①自噬起始  

当细胞感受到压力信号（如营养缺乏、缺氧、细胞器损伤）时，会激活自噬相关基因（ATG 家族）。其中ULK复合物（自噬启动关键复合物）和Beclin-1复合物（调控膜结构形成）被激活。

②隔离膜和细胞自噬体的形成 

在Beclin-1复合物等调控下，细胞内的膜结构逐渐聚集、延伸，形成双层膜的自噬前体膜（隔离膜），进一步组装、扩张并包裹待降解物质（如受损线粒体、蛋白聚集体），形成成熟细胞自噬体。

③细胞自噬体与溶酶体融合 

成熟自噬体向溶酶体（含多种水解酶的细胞器）移动，最终与溶酶体融合，形成自噬溶酶体。此时自噬体内的物质暴露在溶酶体酶环境中。

④细胞自噬体的裂解 

自噬溶酶体内的水解酶（如蛋白酶、核酸酶）将包裹的物质彻底分解为氨基酸、脂肪酸、核苷酸等小分子供细胞再利用。

图2 细胞自噬的发生过程^[2]。

LC3蛋白，即微管相关蛋白轻链3，是自噬过程中最重要的标志物之一。哺乳动物的LC3可分为三种：LC3A、LC3B和LC3C。其中，LC3B应用广泛。正常状态下，LC3以可溶性的LC3-I形式存在于细胞质；自噬激活时，LC3-I经泛素样体系所修饰，最终与磷脂酰乙醇胺（PE）结合，转化为膜结合型的LC3-II并锚定在自噬体的内、外膜上，一方面帮助自噬体膜扩张、包裹受损细胞器或蛋白等底物，另一方面介导自噬体与溶酶体的融合。LC3-II 的水平（如Western blot检测）或细胞内LC3斑点（自噬体）的数量常用于判断自噬活性强弱。

图3 LC3在自噬发生中的路径。

自噬单荧光标记病毒如GFP-LC3病毒，可用于标记自噬强弱。当细胞内没有自噬发生时，GFP-LC3会均匀地分散在细胞质中，一旦细胞发生自噬活动，GFP-LC3融合蛋白就会聚集并转位到自噬体膜上，通过荧光显微镜下观察荧光斑点数量代表自噬体多少，就代表了自噬活动的强弱。

1. 通过慢病毒介导GFP-LC3转染CMECs 48小时后，经不同浓度DOX处理并在荧光显微镜下观察统计荧光斑点，发现随DOX剂量增高，细胞呈现DOX剂量依赖性自噬抑制，这表明DOX抑制细胞自噬。

图4细胞呈现DOX剂量依赖性自噬障碍^[3]。

mRFP-GFP-LC3病毒可用于标记及追踪LC3以及自噬流的变化。GFP对酸性环境敏感，自噬溶酶体内的酸性环境会导致PH下降，GFP荧光淬灭，而mRFP是稳定的荧光表达基团，不受外界影响。通过观察细胞内荧光斑点颜色的变化，即新形成的自噬体呈现黄色斑点（GFP+/mRFP+），与溶酶体融合后的自噬溶酶体呈现仅红色斑点（GFP-/mRFP+），可以直观地、动态地评价自噬流进程。

1. NSC是大脑神经发生微环境中能自我更新和分化神经细胞的干细胞总称，由具有不同作用的静止（qNSCs）和激活（aNSCs）细胞群体组成。转录组学分析表明静止和激活的NSC的蛋白质稳态网络存在差异，aNSCs具有活性蛋白酶体，而qNSCs则含有大的溶酶体。在3月龄小鼠原代培养的qNSCs和aNSCs细胞中表达mCherry-GFP-LC3，自噬体同时显示GFP和mCherry荧光（黄绿色），而自噬溶酶体仅显示mCherry荧光（红色），因为GFP因溶酶体的酸度而变性淬灭。结果发现qNSCs包含许多大溶酶体，这些溶酶体已与自噬体融合形成自溶酶体，但尚未降解其内容物。

图5 qNSCs和aNSCs细胞的自噬情况^[4]。

2. 将稳定表达mRFP-EGFP-LC3载体的HCT116细胞和HT29细胞与具核梭杆菌（F. nucleatum）共培养。结果发现，F. nucleatum诱导后，HCT116 细胞和 HT29 细胞中红绿荧光斑点数目增加。透射电子显微镜显示，F. nucleatum共培养的HCT116细胞和HT29细胞中自噬囊泡的形成增加。这些结果表明F. nucleatum可激活细胞中的自噬通路。

图6 F. nucleatum诱导细胞自噬发生^[5]。