科研突破丨Nat. Methods丨ATLAS：可限定起始神经元 “顺向跨单示踪”工具

本文介绍了一种名为ATLAS（anterograde transsynaptic label based on antibody-like sensors）的顺向跨突触示踪技术，它基于合理设计的蛋白质，能从基因确定的神经元进行顺向跨突触标记。通过mRNA展示筛选出与GluA1受体结合的AMPA.FingR（AF），构建ATLAS蛋白并验证其能介导跨突触示踪。实验表明，ATLAS在体内外均能实现严格顺向、跨单突触、活动依赖的神经元示踪，且不阻断突触传递，还可用于标记多种神经环路，其组件可独立替换或修改，为神经环路研究提供了有力工具。

将ATLAS-Cre转染到感染AAV编码floxed-GFP报告基因（AAV8-DIO-GFP)的解离细胞培养物中，观察到一些表达GFP和Cre但未被起始细胞标记物At标记的细胞，这与Cre的跨神经元转运以及floxed等位基因的重组情况相符，意味着Cre已被转运至细胞核，这些结果证明ATLAS能介导跨突触示踪并提供遗传访问。

将AAV8-ATLAS-Cre注射到小鼠的内侧前额叶皮层（mPFC）中，将AAV8-DIO-mCherry注射到小鼠的纹状体（Str）中，以追踪从mPFC到Str的单向投射。1周后，在mPFC中发现At染色标记的阳性细胞，在Str中发现有大量mCherry阳性细胞，表明ATLAS能介导跨突触运输Cre，使细胞被mCherry标记。

构建AAV8-DIO-ATLAS-FLP，将Lenti-CamkII-Cre慢病毒与AAV8-DIO-ATLAS-FLP共注射到野生型小鼠的初级视觉皮层（V1），并将AAV8-fDIO-mCherry注射到小鼠的上丘（SC）中，其中对照组只在SC注射病毒。结果显示，实验组V1区At染色阳性，SC区有大量mCherry阳性细胞，而对照组仅有少量弱阳性细胞。

将AAV8-DIO-ATLAS-FLP注射到VIPR2-Cre小鼠的背外侧膝状核（dLGN），AAV8-fDIO-mCherry注射到小鼠的V1中。结果显示，At染色特异性定位于dLGN，而V1区有mCherry阳性细胞，证明ATLAS能够在野生型和转基因小鼠中从Cre阳性神经元实现顺向示踪。

通过补充外源BACE后评估ATLAS示踪效率变化，将AAV8-BACE-HA和AAV8-ATLAS-Cre以1:1比例共同注射到mPFC时，它对于 mCherry 标记的突触后细胞的数量没有显著影响，而将AAV8-BACE-HA和AAV8-ATLAS-Cre以5:1比例共同注射到mPFC时，Str中mCherry标记的细胞数量显著增加，约10%的突触后神经元被标记。因此，在补充外源性BACE后，ATLAS对Str细胞的标记密度与YFV（基于黄热病YFV-17D灭活疫苗顺向示踪系统）相当。

由于ATLAS的摄取是由GluA1受体介导的，而抑制性突触上不存在GluA1受体，因此如果在抑制性神经元中表达ATLAS，任何跨神经元标记都必然是非突触性的。在SST-Cre小鼠中，将AAV8-DIO-ATLAS-FLP和AAV8-fDIO-mCherry注射到V1，2周后发现几乎所有mCherry标记的细胞都与At共标记，表明ATLAS通过跨突触来标记突触后神经元。

为了测试 ATLAS 是否破坏突触传递，在野生型小鼠的mPFC共注射AAV8-ATLASsn-Cre、AAV8-BACE-HA和AAV8-DIO-ChR2-GFP，在Str注射AAV8-DIO-mCherry，4周后切片做脑片记录，结果发现当记录标记的突触后细胞时，与未标记细胞相比，ChR2诱发的EPSC的振幅表现出不显著的增加，表明ATLAS没有阻断突触传递，且ATLAS不引起可检测的毒性。

在V1-Str环路中测量光遗传诱发电流，将AAV8-ATLASsn-Cre和AAV8-BACE-HA混合注射到V1，并将AAV8-DIO-mCherry/tdTomato注射到背内侧纹状体（DMS）。两周后，在V1中与第一次注射相同的区域注射AAV8-DIO-ChR2-GFP，以操控由ATLAS标记的突触前输入，同时尽量减少ATLAS和ChR2之间的表达竞争。结果发现ATLAS标记的细胞比未标记细胞更可能接受突触输入，且突触连接更强的细胞更易被标记。

将AAV8-DIO-ATLAS-FLP和Lenti-hsyn-Cre注射到Str，AAV8-fDIO-mCherry注射到mPFC，结果显示在Str中具有丰富的At标记，表明ATLAS在高水平表达，但在mPFC中没有发现高于背景的标记，因为从mPFC到Str的投射是单向的，所以证明ATLAS不介导逆行标记。然后，示踪V1-SC-副视核（PBG）途径，将AAV8-ATLAS-Cre注射到V1，AAV8-DIO-mCherry注射SC和PBG，发现ATLAS只在SC有mCherry标记，而在PBG无明显高于背景的标记，表明其为单突触示踪。此外，将AAV8-ATLAS-Cre注射到SC，AAV8-DIO-mCherry注射到PBG，发现在PBG有标记，说明ATLAS能够追踪从SC到PBG的神经环路。因此，由ATLAS介导的跨突触标记完全是顺行性的单突触标记。

由于ATLAS通过从突触小泡中释放AF-重组酶来介导跨突触标记，因此跨突触标记很可能具有活动依赖性。为了在体内测试跨突触标记的活动依赖性，在mPFC注射AAV8-ATLASsn-Cre和AAV8-hHM3Dq-mCherry，在Str注射AAV8-DIO-GFP到Str，结果发现与CNO未处理小鼠相比较，用CNO处理小鼠的Str中GFP标记的细胞数量和总荧光强度显著增加，表明ATLAS介导的跨突触标记具有活动依赖性。

尽管VAMP2被广泛用作突触前标志物，但当高水平表达时会产生毒性，当ATLAS在mPFC中表达2周和4周时，可以观察到毒性。因此，对ATLAS进行了优化，将VAMP2的胞质结构域替换为抗突触结合蛋白1（SYTnb）的纳米抗体，构建SYTnb-VAMP2Δ-At-BACEcs-AF-Cre（ATLASsn-Cre），在mPFC中表达ATLASsnCre 2或4周时，没有观察到毒性。体外实验将ATLASsn-Cre转染至皮质神经元的解离细胞培养物中，同时用AAV8-DIO-mCherry感染细胞，观察到大量被mCherry标记但未被At标记的细胞，表明它们通过跨突触方式被标记。

在体内测试中，将AAV8-ATLASsn-Cre与AAV8-BACE-HA共同注射到小鼠mPFC，将AAV8-DIO-mCherry注射到Str。孵育2周后，在mPFC中观察到At的表达，Str中检测到大量mCherry标记。突触后mCherry标记的背侧区域与代表突触前末端的At标记几乎完全共定位，这与ATLASsn-Cre介导跨突触标记的结果一致。此外，在M1-Str和M1-丘脑（Thal）环路的示踪进一步证实了ATLASsn-Cre可以介导跨突触标记。

进一步验证ATLASsn-Cre的通用性，利用其示踪了三条额外神经环路：分别为听觉皮层（A1）至下丘、mPFC至屏状核，以及内嗅皮层至海马的投射。在每组实验中，均向突触前注射AAV8-ATLASsn-Cre和AAV8-BACE-HA，并向对应的突触后区域注射AAV8-DIO-GFP。孵育2周后，对突触前细胞进行At染色，对突触后细胞进行GFP染色。结果显示，每组实验中均观察到同时存在At和GFP标记的细胞，表明跨突触标记效率良好。这些结果表明，ATLASsn-Cre能够有效示踪多种不同神经环路。

此外，为了了解跨突触标记发生的时间进程，在mPFC中共表达AAV8-ATLASsnCre和AAV8-BACE-HA，在Str中表达AAV8-DIO-GFPmPFC，分别感染4、7、14、21天，结果发现突触后标记细胞在注射后4-7天开始出现，7天后数量和标记强度显著增加，21天时仍有增长；突触前标记细胞在1周后数量基本稳定。ATLASsn-Cre跨突触标记的细胞数量在前7天显著增加，之后增速放缓，但总荧光强度呈相对线性增长；而突触前标记细胞数量在首周后基本保持稳定。

在大鼠中注射AAV8-ATLASsn-Cre和AAV8-BACE-HA到腹侧海马CA1区，AAV8-DIO-tdTomato到伏隔核（ACB），结果观察到CA1中有At染色，ACB有大量tdTomato标记细胞。此外，下丘脑外侧区（LHA）内也有tdTomato的轴突标记，证明ATLAS在大鼠中也能介导跨突触标记。

ATLAS示踪技术是一种基于合理设计蛋白质的顺向跨突触示踪方法，具有多方面优势：

• 仅顺向单突触示踪，可精准映射神经元连接；

• 不依赖病毒复制，无毒性，不影响突触传递；

• 具有活动依赖性，能标记与行为相关的活跃神经回路；

• 组件模块化可独立替换或修改去适配不同受体，能用于多种动物。

该技术存在局限性：

• 依赖重组酶报告系统，需在突触后细胞表达相关基因，操作复杂；

• 整体标记效率不足，且受时间影响，需补充外源性BACE酶改善。