GABA能神经传递在塑造神经回路动力学、维持大脑兴奋与抑制平衡至关重要，其信号异常与癫痫、精神分裂症和自闭症等多种神经和精神疾病相关。现有测量GABA水平的技术存在灵敏度、时空分辨率等局限，如微透析时间分辨率低，仅限于分钟级，电生理方法无法适用于大规模神经元群体检测且难以区分GABA能信号传导与其他超极化电流。此前开发的基因编码荧光传感器iGABASnFR1虽能监测GABA能活动，但灵敏度和动态仍然有限，在神经元培养中，其亲和力半最大有效浓度（EC50）为~30 μM，EC50是指能引起50%最大效应的药物浓度，EC50值越低，表明探针与GABA的亲和力越强，最大荧光响应度 ΔF/F为~0.6，整体性能不适用于高分辨率、光子限制的成像应用。

研究人员以iGABASnFR1为基础，针对蛋白中39个位点进行近饱和诱变，这些位点分布在GABA结合位点附近、蛋白铰链区或周围、cpSFGFP及在两个配体结合和cpGFP结构域之间的界面上。通过单位点突变体的组合提高性能，经两轮筛选，最终获得动态范围和表达的最佳组合iGABASnFR2（结合GABA后荧光强度增加），以及具有反向信号的最佳变体iGABASnFR2n（结合GABA后荧光强度降低）（图1）。

图1 用于改进iGABASnFR的场刺激筛选

在上升时间、峰值ΔF/F和信噪比等性能方面，iGABASnFR2在所有场刺激条件下的性能都明显优于iGABASnFR1。用10个动作电位（APs）刺激时，iGABASnFR2的峰值ΔF/F达到0.80±0.12，是iGABASnFR1的4.2倍，信噪比为70.5±10.7，比iGABASnFR1提高了3倍，上升时间为38±10 ms，相比iGABASnFR1也有所加快。具有反向信号的iGABASnFR2n的峰值ΔF/F是iGABASnFR1的3.2倍，信噪比比 iGABASnFR1高30%（图2）。这表明iGABASnFR2和iGABASnFR2n在突触释放过程中检测GABA动力学方面都表现出广泛改善的性能。

图2 培养神经元中iGABASnFR变体的表征

对于体内应用，传感器的有效性取决于其对 GABA 的亲和力以及 GABA 结合的动力学。在亲和力方面，iGABASnFR2在细胞上的EC50为6.4±0.21 μM ，亲和力比iGABASnFR1高7倍，这使得它对GABA的结合能力显著增强。在动力学方面，iGABASnFR1呈现双相动力学，而iGABASnFR2 和iGABASnFR2n的动力学可用单指数函数准确拟合，表明其配体结合与荧光变化之间的关系更为简单。在光谱特性方面，iGABASnFR2、iGABASnFR2n与iGABASnFR1的1p和2p光谱相似，它们的表观pKa值也相似（图3）。

图3 iGABASnFR变体的生物物理特性

在视网膜的突触传递研究中，研究人员利用Cre-Lox系统，使用iGABASnFR1或iGABASnFR2病毒转染星爆无长突细胞（SAC），注射后6-8周解剖视网膜并进行双光子成像。结果显示，iGABASnFR1对全视野刺激虽有微弱信号，但检测单个试验响应困难，检测运动刺激方向选择性时，即便试验平均也难以实现。而iGABASnFR2对静态闪光的响应在单个试验中即可检测到，且面对运动刺激时，能清晰观察到方向选择性GABA释放。通过计算响应幅度指数（RAI）和响应可靠性等指标发现，iGABASnFR2的响应幅度和可靠性均显著高于iGABASnFR1，其响应可靠性均值为0.66 ± 0.14，而iGABASnFR1仅为 0.41 ± 0.11（图4）。此外，iGABASnFR2的信号信噪比也明显更高，方向选择性测量更准确，证实了视网膜中SAC以方向选择性方式释放GABA的假设。

图4 iGABASnFR2报告视黄素中的方向选择性

iGABASnFR2和iGABASnFR2n对GABA亲和力显著提升，检测灵敏度更高，iGABASnFR2 在视网膜实验表现出色，能检测更多响应，为视觉运动诱发的 GABA 释放提供更精确测量，为研究视网膜方向选择性起源提供重要依据，是研究GABA能抑制在神经系统中作用的强大工具，有助于探究相关神经和精神疾病发病机制。

谷氨酸是脊椎动物中枢神经系统主要神经递质，其分子数量少、停留时间短，使得突触释放的光学测量极具挑战性，尤其是体内同时记录多个突触时。荧光蛋白神经递质指示剂iGluSnFR虽然可以检测单个突触囊泡释放，但iGluSnFR3体内信噪比不足以同时记录几十个突触。随着成像突触数量增加，总激发功率分配到各突触导致信噪比降低，且显微镜体素速率（指单位时间内获取或处理体素的数量，体素是三维空间中图像的基本单元）有限，在采样率和记录突触数量间存在权衡，需要更亮、更灵敏的指示剂满足测量需求。

研究人员对两个iGluSnFR3变体（iGluSnFR3.v857和iGluSnFR3.v867）的41个先前确定的位点进行饱和诱变，构建包含1640个变体的文库；经过培养神经元的场刺激筛选，即基线荧光亮度（F0）、峰值响应幅度（∆F/F0）以及上升和衰减时间（Ton和Toff）等参数的测量，筛选出12个点突变构建1728个变体的组合文库；使用广义线性模型（GLM）分析每个突变的影响及其相互作用；随后从组合筛选中选择70个变体，在经河豚毒素（TTX）沉默的培养神经元中对自发突触谷氨酸释放进行成像测试，筛选具有快速衰减动力学和改善信噪比的变体；最后挑选7个变体，进行小鼠视觉皮层体内测试，通过双光子成像评估多个指标，综合考量后选定两个表现最佳的变体v8880和v9601，分别命名为iGluSnFR4s（慢速失活）和iGluSnFR4f（快速失活）（图5）。

图5 在原代神经元培养物中筛选iGluSnFR变体

在小鼠视觉皮层中，通过单细胞电穿孔在初级视觉皮层（V1）神经元中稀疏表达iGluSnFR变体，使用细胞贴附记录和双光子成像来表征记录神经元上单AP诱发的谷氨酸瞬变，结果发现iGluSnFR4f、iGluSnFR4s均能有效检测单个AP诱发的谷氨酸释放信号，表现出更高的灵敏度和更快的衰减速率。此外，在信号衰减特性上具有明显区分度，iGluSnFR4f 更适合跟踪快速的突触动力学，iGluSnFR4s 则在信号持续时间上有独特优势（图6a-d）。

在检测信号的空间特异性上，研究人员通过向小鼠呈现定向漂移光栅刺激，并对V1中神经元树突的反应进行成像来评估。结果显示，iGluSnFR4f和iGluSnFR4s均能以高信噪比、高特异性地报告单个突触的信号，且信号定位在树突棘上。iGluSnFR4f的响应在时间上更为尖锐，而iGluSnFR4s的响应则具有更大的峰值振幅和积分面积（图6e-k）。

图6 iGluSnFR4在小鼠视觉皮层中的表征

在小鼠的腹侧后内侧丘脑（VPM）注射iGluSnFR变体，利用自适应光学双光子（AO-2P）显微镜成像在小鼠初级体感皮层（vS1）记录丘脑皮质轴突的突触谷氨酸信号。在对小鼠进行节奏性吹气刺激和自愿胡须运动实验时发现，它们均能在2-30Hz的刺激频率下产生快速起始的响应，而且iGluSnFR4f在高达20Hz的刺激频率下仍然能检测谷氨酸能信号，在自由胡须触摸实验中，iGluSnFR4s由于其较慢的衰减时间，在捕获快速重复触摸事件的响应时表现不佳，而 iGluSnFR4f则能对不同类型的触摸事件（包括之前300ms内无触摸和之前150ms内至少有1次触摸的事件）产生可分辨的响应，且平均响应幅度更高，更适合监测啮齿动物体感皮层的输入信号。

图7 使用AO-2P扫描显微镜对丘脑皮质轴突中的快速动力学进行成像

在小鼠中脑腹侧被盖区（VTA），将iGluSnFR4s和其他对照探针分别表达在VTA的GABA能神经元中，利用光纤光度法记录小鼠在接受水奖励时的响应。iGluSnFR4s产生的响应幅度比iGluSnFR3和SF-iGluSnFR更大，分别为 5.62±0.42、1.56±0.16和3.72±0.92、1.54±0.44，在深层脑区的信号检测方面展现出更强的能力。

图8 使用iGluSnFR4s进行深部脑区的光纤光度测量

iGluSnFR4f和iGluSnFR4s具有更高灵敏度和定制化失活速率，iGluSnFR4f跟踪快速突触动力学表现出色，iGluSnFR4s在双光子成像和光纤光度法等需要大信号的应用中优势明显。两个探针能检测多种自然的突触传递，为研究神经元计算、突触生理学以及大脑疾病潜在机制提供有力工具，推动神经科学领域相关研究进展。