文献解读丨 “红绿探针”让L-乳酸代谢动态“无死角”可视化

L-乳酸不再是代谢废物，而是参与神经（如ANLS假说）、肿瘤微环境、免疫调节的关键能量来源和信号分子，其跨细胞/亚细胞动态研究需求迫切。2021年开发的初代胞外探针eLACCO1.1存在膜定位聚集、荧光响应弱（ΔF/F=4）问题；现有胞内探针均为绿色荧光，无法与绿色工具（如GCaMP）协同使用，且响应强度有限。

2023年发表于《Nature Communications》的研究文章“Lactate biosensors for spectrally and spatially multiplexed fluorescence imaging”，开发了一对光谱和功能正交的基因编码L-乳酸荧光生物探针（图1）：绿色荧光细胞外探针eLACCO2.1（第二代升级产品）与红色荧光细胞内探针R-iLACCO1（首款红色胞内探针）。eLACCO2.1基于TTHA0766蛋白，经定向进化优化后ΔF/F达14（是初代eLACCO1.1的3.5倍），通过HA引导序列+NGR GPI锚定实现高效膜定位，Kd=1.9mM适配胞外生理浓度，可检测脑切片及活体小鼠胞外L-乳酸动态；R-iLACCO1基于LldR蛋白，插入cpmApple，ΔF/F达20（为现有胞内探针最高），且开发了R-iLACCO1.1/1.2亲和力变体（Kd分别为3.0mM/4.0mM），无Ca²⁺依赖。二者可协同实现培养细胞（如HeLa、神经元）、脑切片及活体小鼠中胞外-胞内L-乳酸的光谱/空间多通道成像，还首次观测到L-乳酸在线粒体和内质网间的穿梭，为代谢研究提供新工具。

图1 eLACCO和R-iLACCO示意图及其对L-乳酸的响应机制

在哺乳动物细胞中表达HA-eLACCO2.1-NGR，其膜定位良好（图2a），而CD59-eLACCO1.1-CD59会形成荧光斑点。向表达eLACCO2.1的HeLa细胞加10mM L-乳酸，荧光强度显著升高，ΔF/F=8.8±0.2（图2b、c），为eLACCO1.1（ΔF/F=6.4±0.2）的138%（图3c）。对照探针deLACCO1膜定位正常且对L-乳酸无响应（图2a-d），eLACCO2.1对L-乳酸的原位表观Kd=580μM（图2d）。eLACCO2.1荧光依赖Ca²⁺，表观Kd=270μM，远低于脑组织（1.5-1.7mM）和血清（0.9-1.3mM）的胞外Ca²⁺浓度（图2e）。动力学测试显示，其快于eLACCO1.1（图2f）。无L-乳酸时，eLACCO2.1光稳定性与EGFP相当，高于eLACCO1.1；有L-乳酸时，其光稳定性低于eLACCO1.1（图2g）。deLACCO1光稳定性始终低于EGFP。

图2 eLACCO2.1在HeLa细胞的表征

为了表征eLACCO2.1在神经元表面的性能，在hSyn启动子调控下，HA-eLACCO2.1-NGR在大鼠原代皮质/海马神经元中呈明亮膜定位荧光，而CD59-eLACCO1.1-CD59有荧光斑点（图3h）。加10mM L-乳酸后，eLACCO2.1的ΔF/F=8.1±0.7，为eLACCO1.1（ΔF/F=1.5±0.2）的5.4倍（图3i-j）。

为了验证eLACCO2.1是否可用于检测星形胶质细胞表面的L-乳酸浓度变化，在gfaABC1D启动子调控下，eLACCO2.1在大鼠原代皮质/海马星形胶质细胞中表达良好（图3h），加10mM L-乳酸后ΔF/F=7.3±1.0（图3i、k），优于eLACCO1.1（ΔF/F=4.9±0.5），deLACCO1无响应。综上，优化引导序列和锚定域的eLACCO2.1性能优于eLACCO1.1，可成像神经元、星形胶质细胞表面胞外L-乳酸动态。

图3 eLACCO2.1在神经元和星形胶质细胞的表征

为了确定eLACCO2.1是否可用于检测完整组织中内源性L-乳酸浓度的变化，将AAV（hSyn启动子调控HA-eLACCO2.1-NGR）转染小鼠新皮质（图4l），脑切片离体实验中：无糖刺激使eLACCO2.1荧光降低（图4m），与胞外L-乳酸摄取一致；theta爆发刺激（一种特定模式的电刺激）使荧光显著升高，15分钟未消退（图4n），与高频刺激升高胞外L-乳酸的报道一致。综上，eLACCO2.1可检测完整组织中胞外内源性L-乳酸变化。

图4 eLACCO2.1在急性脑切片中的表征

为了验证R-iLACCO系列变体对哺乳动物细胞内源性L-乳酸动态的监测能力，在多种细胞及刺激条件下进行活细胞成像，并与已知L-乳酸探针对比（图5g-j）：在葡萄糖饥饿细胞经葡萄糖处理后，糖酵解增强使胞内L-乳酸升高，R-iLACCO系列荧光均升高（图5g），其中低亲和力R-iLACCO1.2响应最强，远超其他探针；单羧酸转运体（MCT）抑制剂可抑制细胞内L-乳酸的外流，从而导致细胞内L-乳酸浓度升高。向HeLa细胞施加MCT抑制剂AR-C155858后，R-iLACCO1/1.1/1.2的ΔF/F分别为0.08±0.01、0.19±0.03、0.30±0.02（图5h），R-iLACCO1.2响应仅次于iLACCO1；原代神经元与星形胶质细胞加AR-C155858后，R-iLACCO系列荧光均显著升高（图5i、j）。虽胞内L-乳酸升高常伴随pH下降（可能降低荧光蛋白探针信号），但所有条件下R-iLACCO系列均呈显著荧光升高（图5）。综上，R-iLACCO系列变体在监测哺乳动物细胞内L-乳酸动态中具显著优势与应用价值。

图5 哺乳动物细胞中R-iLACCO变异体的表征

为了验证eLACCO2.1体内性能，检测清醒小鼠视觉皮层神经元中eLACCO2.1在侧脑室（i.c.v.）注射L-乳酸后的荧光响应（图6a）。结果显示，与生理盐水相比，L-乳酸组eLACCO2.1荧光响应显著（图6b），对照deLACCO1荧光几乎无变化（图6c），表明eLACCO2.1是体内功能性胞外L-乳酸探针。

为了探究eLACCO2.1对自由活动小鼠内源性L-乳酸的检测能力（已知胰岛素注射会降低小鼠脑内胞外L-乳酸），在小鼠海马神经元中表达eLACCO2.1，记录腹腔（i.p.）注射胰岛素后的荧光响应（图6d）。结果显示，与生理盐水相比，胰岛素组eLACCO2.1荧光显著降低，deLACCO1无明显变化（图6e），表明其可检测自由活动小鼠内源性L-乳酸动态。

为了验证R-iLACCO1.1体内监测胞内L-乳酸的能力（已知刺激小鼠胡须会升高躯体感觉皮层神经元胞内L-乳酸），在小鼠躯体感觉皮层神经元中表达R-iLACCO1.1，观察胡须刺激后的荧光响应（图6f-g）。浅麻醉小鼠成像显示，R-iLACCO1.1呈刺激依赖性荧光增强（图6h-i），表明其可监测活体小鼠内源性L-乳酸动态。

图6 小鼠体内L-乳酸成像

为了观察胶质母细胞瘤细胞胞质L-乳酸生成与胞外释放，在饥饿细胞中共表达eLACCO2.1（胞外成像）与R-iLACCO1.2（胞内成像）（图7a）。葡萄糖刺激后，二者荧光同步升高（图7b-c），表明胞质生成的L-乳酸快速释放至胞外；且胞内L-乳酸信号出现短暂峰值，此时胞外信号斜率显著变小。因MCT抑制剂存在时该峰值几乎消失，推测其为胞质L-乳酸生成与MCT介导外流平衡的结果。为了探究L-乳酸在胞质与细胞器间的穿梭，将R-iLACCO1.2靶向线粒体基质或内质网（ER），并在饥饿细胞中共表达胞质iLACCO1（图7d-i）。葡萄糖处理后，线粒体基质、ER中R-iLACCO1.2的荧光均随胞质iLACCO1同步升高，表明胞质生成的L-乳酸除释放至胞外，还会穿梭至线粒体基质与ER。

图7 光谱和空间多路复用的L-乳酸成像