腺相关病毒（AAV）载体是目前体内基因治疗递送的主要平台。AAV属于细小病毒科依赖病毒属，其生命周期依赖辅助病毒。重组AAV（rAAV）去除了病毒编码序列，保留反向末端重复序列（ITRs）用于基因组复制和包装，使其具有低免疫原性等优势。在载体设计方面，通过自然发现、理性设计、定向进化和计算机设计等方法开发新型衣壳，并对基因组进行优化以控制基因表达、容纳大基因和增强持久性。rAAV已在多种疾病的临床治疗中应用，如治疗脂蛋白脂肪酶缺乏症的Glybera和治疗视网膜营养不良的Luxturna已获批上市。然而，AAV基因治疗仍面临大规模生产、成本、质量控制、免疫屏障等挑战，未来需多学科协作推动其发展。
图1 AAV基因治疗开发的关键里程碑
AAV载体是基因治疗递送的重要平台，在疾病治疗方面展现出巨大潜力，但其发展也面临诸多挑战。
AAV病毒特性：AAV属于细小病毒科依赖病毒属，生命周期依赖辅助病毒，常见的辅助病毒如腺病毒（AdV）。AAV病毒由直径约26nm的二十面体蛋白衣壳和约4.7kb的单链DNA基因组构成，衣壳包含VP1、VP2和VP3三种亚基，这些亚基相互协作，共同保护内部的基因组，而基因组两端的ITRs则在复制和包装中起关键作用。其中，AAV基因组中的rep基因编码4种复制蛋白，参与病毒基因组的复制过程；cap基因编码衣壳亚基，决定衣壳的组成和结构；还有专门编码装配激活蛋白（AAP）的基因，该蛋白对病毒例子的装配至关重要。
rAAV载体特征：rAAV在保留野生型AAV的衣壳序列和结构的基础上，对基因组进行了改造，它去除了所有AAV蛋白编码序列，替换为治疗基因表达盒，仅保留ITRs。因此，rAAV的包装容量存在一定限制，小于5.0kb，在设计时需考虑治疗基因序列的长度和调控元件的大小。
rAAV转导过程：rAAV通过与细胞表面受体结合，经网格蛋白介导的内吞作用进入细胞，在细胞内经历一系列pH依赖的结构变化，通过细胞骨架网络运输，经核孔进入细胞核。此时，释放的单链基因组必须转化为双链才能进行转录，这一转化过程可通过第二链合成或链退火两种方式实现，之后基因组可环化形成游离 DNA，实现基因表达。
图2 rAAV转导途径示意图
衣壳开发策略：为获得新特性，研究人员采用多种方法开发新型衣壳，包括自然发现（如从人类肝脏组织分离出AAV9，可跨越血脑屏障）、理性设计（如对AAV2进行改造，改变其靶向性和免疫原性）、定向进化（如CREATE方法筛选出可跨越血脑屏障的AAV-PHP.B）和计算机设计（如预测出Anc80，在多种组织有良好疗效）。
基因组设计要点：首先是控制基因表达，通过选择合适的启动子控制其在特定的细胞或组织中精准表达，同时进行密码子优化提高基因表达的效率和特异性；采用设计缩短基因（如治疗杜氏肌营养不良症的微型肌营养不良蛋白基因），或者通过共递送两个AAV载体等策略容纳大基因；利用基因编辑促进基因组整合、插入支架/基质附着区域（S/MAR）序列等方法增强基因表达的持久性。
图3 衣壳发现与工程的四种主要方法的信息图
临床应用现状：截至2018年11月13日，已有145项涉及rAAV的干预性临床试验在ClinicalTrials.gov注册。AAV1（Glybera）和AAV2（Luxturna）已获监管批准用于商业用途，目前临床试验中常用的衣壳血清型包括AAV2、AAV8、AAV9等。
治疗策略分类：基因替换主要用于治疗隐性单基因疾病（如Glybera治疗脂蛋白脂肪酶缺乏症，Luxturna治疗视网膜营养不良）；基因沉默主要针对毒性获得性突变的单基因疾病（如亨廷顿病），但目前大多处于临床前开发阶段；基因添加可用于治疗复杂遗传和获得性疾病（如通过rAAV递送重组抗体治疗HIV感染）；基因编辑利用可编程核酸酶修复疾病相关突变（如体内rAAV基因编辑治疗溶酶体贮积症）。
图4 rAAV介入基因治疗临床试验概述
生产与成本难题：AAV基因治疗药物价格昂贵（如Glybera曾达120万美元/患者，Luxturna为42.5万美元/眼治疗），造成这一现象的主要原因是生产规模扩大困难且成本高，目前的生产系统效率较低，临床试验成本也较高。
质量控制问题：空壳与完整颗粒比例在不同制备中差异大（空壳可占20%-98%）；载体效力评估受多种因素影响，体内模型重复性差，体外替代试验发展迅速；DNA组成方面，杂质可能带来风险，目前缺乏统一的DNA含量评估标准；衣壳特性方面，新型衣壳需要准确评估稳定性和异质性。
免疫相关障碍：人体中存在针对AAV衣壳的中和抗体（NAbs），它们会阻碍基因递送，AAV给药后还会引发体液免疫和细胞免疫反应，影响治疗效果。此外，AAV载体还会激活先天免疫，需要采取策略降低免疫反应。
图5 成功递送rAAV基因的免疫屏障
AAV载体具有多种优势。其一，AAV目前被认为不引起人类疾病，安全性较高。其二，重组AAV去除了病毒编码序列，仅保留ITRs，这使得其免疫原性和细胞毒性较低。其三，AAV载体的宿主范围广泛，能够感染多种细胞和组织。其四，AAV载体可实现长期稳定的基因表达，其基因组可形成游离 DNA在细胞中持续存在。
AAV载体的免疫屏障对基因治疗影响显著。血液中存在的NAbs会有效阻止rAAV基因递送，尤其是静脉注射时；AAV给药后，载体衣壳会引发强烈的体液免疫反应产生NAbs，导致大多情况下无法再次给药；衣壳还能触发细胞毒性T淋巴细胞（CTL）介导的细胞毒性，可能清除转导细胞，造成转基因表达的丧失；转基因产物可能引发适应性免疫反应，产生转基因产物特异性抗体和CTL，影响治疗效果；此外，AAV载体还会激活先天免疫，促进炎症细胞因子产生，增强适应性免疫反应。
在生产与成本方面，研究开发更高效的生产系统，如优化细胞培养条件和转染方法，提高载体产量，降低成本；探索新的生产平台，如无细胞生产系统。质量控制上，开发更精确的检测方法，准确评估空壳与完整颗粒比例、载体效力、DNA组成和衣壳特性等；建立统一的质量控制标准。针对免疫屏障，研究如何改造AAV衣壳，消除NAb结合位点，降低免疫原性；探索免疫调节策略，如诱导免疫耐受，抑制免疫反应，以提高基因治疗效果。
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