哺乳动物大脑作为高度复杂的器官，其皮层由数百种不同类型的细胞构成，这些细胞能够根据形态特征、功能表现和分子表达谱等共同特性进行多维度分类。明确每种细胞类型对皮层所主导的生理过程的贡献，对于理解其在健康和疾病状态下的功能至关重要。2025年5月29日，美国国立卫生研究院 “The BRAIN Initiative”项目的重要进展在Cell期刊上发布，论文题目为“A suite of enhancer AAVs and transgenic mouse lines for genetic access to cortical cell types”，研究人员利用小鼠和人类的皮层细胞类型转录组与表观基因组分类法，定义标记基因和假定增强子，并创建了一个大型工具包，包含15种转基因驱动小鼠品系、2种报告小鼠品系以及超过1000种不同的增强子AAV载体，用于特异性靶向皮层亚细胞群体，部分工具特异性大于90%。
研究人员通过Addgene和Jackson Labs平台共享了所有工具。本研究中SYFP2表达载体的相关实验数据可通过遗传工具图谱网络门户获取，艾伦研究所新创建的公共网络资源遗传工具图谱（RRID:SCR_025643；https://portal.brain-map.org/genetic-tools/genetic-tools-atlas）和BioFileFinder（BFF；RRID:SCR_026930；https://bff.allencell.org/），其中还包括来自单个scRNA-seq实验的数据。
图1 两种遗传工具生成和表征策略
研究人员基于历史基因组学数据和新生成的单核多组学数据（snMultiome），构建了跨物种（小鼠/人类）亚类分辨率转录组和表观基因组分类法。小鼠数据来自初级体感区（SSp）、初级运动区（MOp）和初级视觉区（VISp），人类数据来自颞中回（MTG）。这些方法能够测量单个细胞的数万种分子特性，并将它们分类为分子定义的细胞类型，还能发现与细胞类型一致的标记基因和基因组增强子，从而创建靶向皮层细胞的工具。设计并测试了1164种独特的增强子AAV载体，其中802种为候选序列（643种小鼠来源，159种人类来源），约 40%（313种）表现出靶向特异性。每个假定的增强子序列均有唯一ID，由AiE（艾伦研究所发现的增强子）或ExE（基于其他研究组报告的坐标的序列）开头，后接四位数和物种标识符（“m”或“h”对应小鼠或人类）。候选增强子序列从各自的基因组中扩增，并克隆到AAV质粒骨架最小启动子（minBG；minRho；minCMV；或内源性启动子）的上游，驱动黄色荧光蛋白SYFP的表达。
图2 Addgene网站中增强子AAV载体信息
https://www.addgene.org/browse/article/28248370/
质粒被包装进能够穿透血脑屏障的PHP.eB AAV载体，并通过眶后注射RO递送至C57BL/6J小鼠。大约在病毒递送后四周，先通过肉眼检查脑切片荧光图像初筛，再用串行双光子断层扫描（STPT）评估全脑标记，以单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）确定细胞类型特异性。实验聚焦小鼠视皮层，确保数据一致性。通过核心敲除和串联优化，增强子AAV的SYFP2 mRNA表达量平均提升839%，同时保持稳定的特异性。开发Cre、FlpO等重组酶版本，通过突变Cre(R297T)和调整WPRE序列减少非特异性表达。
图3 小鼠脑增强子AAV筛选
研究人员将那些能够从基因上访问特定亚类或簇的最有用工具称为 “名人堂”（HoF，Hall of Fame）标签。这一命名由艾伦研究所的科学家根据多种因素手动分配，例如从scRNA-seq数据得出的特异性和增强子AAV的信号亮度，其目的是帮助研究人员找到靶向特定细胞群体的最佳工具。
图4 名人堂（HoF）增强子AAV
研究人员最后还建立并评估了15种转基因驱动小鼠品系和2种报告小鼠品系，这些品系可单独使用或与增强子AAV结合使用，以从基因上访问甚至最精细分类类别的特定皮层群体。2种报告品系（Ai193和Ai224），Ai193：即TICL-EGFP-WPRE-ICF-tdT-WPRE-hyg，Ai224：也就是TICL-NLS-EGFP-ICF-NLS-dT-hyg，有独立的转录单元，通过表达不同荧光蛋白来报告Cre和Flp的表达，当Cre存在时表达GFP，Flp存在时表达tdTomato，二者都存在时则同时表达两种荧光蛋白。
根据小鼠皮层细胞类型的转录组分类，选择了能够标记特定细胞类型（亚类、超类型或簇）的标志基因。选择了15个基因来生成转基因驱动Cre或Flp系：基于谷氨酸能细胞类型的驱动品系，研究选择了11种标记基因（Batf3、Parm1、Rxfp1、Chrna6、Slco2a1、Cplx3、Cpne4、Ctxn3、Gpr139、Npnt、Slc17a7）构建驱动品系。如Batf3-IRES2-FlpO-WPRE-neo主要靶向L5_IT簇中的L5_IT_VISp_Batf3，但也会标记部分L2/3IT、其他L5_IT、L6_CT类型细胞和小胶质细胞；Chrna6-IRES2-FlpO能特异性标记L5_ET_Chrna6细胞类型。基于GABAergic细胞类型的驱动品系，选择了Lamp5、Sncg、Chodl等基因构建驱动品系。像Lamp5-P2A-FlpO会标记Lamp5 GABAergic细胞，同时也标记L2-3、L5和L6的谷氨酸能细胞；Sncg-IRES-FlpO;Ai65F标记Sncg神经元群体时也会标记内皮细胞。
图5 转基因报告基因和驱动基因系以及与选定增强子AAV的比较
文章创建并公开了超1000种增强子AAV和17种转基因小鼠品系等遗传工具，通过单细胞测序和成像技术验证其特异性，优化工具提升功效，构建跨物种皮层细胞分类法，为皮层细胞类型研究提供标准化工具包与数据资源，推动大脑功能和疾病机制研究，其规模化开发流程也为后续神经科学工具创新奠定方法基础。
原文链接：https://doi.org/10.1016/j.cell.2025.05.002
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