胶质母细胞瘤（GB）是中枢神经系统（CNS）中最常见和最具有侵袭性的恶性原发性脑肿瘤。尽管局部治疗取得了进展，但复杂的异质性导致了治疗耐药性、高复发率和治疗15个月的中位生存期，预后不佳。microRNA-21（miR-21）在几乎所有癌症中的表达均增加了，包括GB。MicroRNA-21（miR-21(a)）（人类hsa-miR-21或小鼠mmu-miR-21a）是一种已知的癌基因，在许多癌症类型中表达丰富。MiR-21(a)促进了胶质母细胞瘤（GB）的进展，而缺乏miR-21(a)则减少了肿瘤的致瘤潜力。在过去的几年中，miR-21(a)作为包括GB在内的许多癌症的潜在治疗靶点。

图1 体外高效编辑小鼠胶质母细胞瘤（GB）中的mmu-miR-21a

实验中构建了一个同时表达SaCas9-KKH和sgRNA质粒，该质粒通过CMV增强子与CAG启动子融合表达SaCas9-KKH，序列中还包含3x FLAG标签、2A肽（p2A）序列以及绿色荧光蛋白（GFP），同时携带由U6启动子驱动的sgRNA3。通过体外转染，评估CRISPR-Cas9系统对mmu-miR-21a的编辑效果，包括mRNA水平的变化和细胞增殖率的影响。对转染后的细胞进行GFP阳性和阴性分选，进一步分析3xFLAG标签的表达和mmu-miR-21a-5p的表达水平，结果显示与对照组相比，转染单质粒的CT-2A细胞中mmu-miR-21a水平显著降低，细胞增殖率降低。随着质粒剂量的增加，转染效率提高，mmu-miR-21a-5p的表达水平降低。但最高剂量（1600 ng）由于细胞死亡增加并未显示出更强的抑制mmu-miR-21a-5p的表达。GFP阳性分选细胞中mmu-miR-21a-5p表达水平显著降低，且观察到这些细胞基因组序列中断。通过Sanger测序和下一代测序（NGS）分析，验证基因组编辑的效果，包括indel的产生和脱靶效应的评估，结果显示SaCas9-KKH编辑在小鼠基因组中的脱靶效应最小，在预测的前5个脱靶位点中基于NGS分析显示出极少的修改读数。NGS分析显示，与CT-2A WT和转染SaCas9-KKH质粒的细胞相比，all-in-one的基因编辑读数修改比例显著提高。综上所述，实验策略成功地通过CRISPR-Cas9系统靶向并编辑了mmu-miR-21a，实现了基因表达的下调和细胞增殖率的降低，同时显示出较高的基因编辑效率和最小的脱靶效应。

图2 使用单质粒sgRNA3-SaCas9-KKH可降低mmu-miR-21a的表达水平

使用AAV8血清型携带GFP基因，在CAG启动子的控制下转导GB细胞系（CT-2A和GL261），并在转导后7天进行评估，成像结果显示GFP转导细胞数量（GL261和CT-2A）约为55%，GFP和Ki-67的共定位作为总细胞的百分比分别为GL261约50%和CT-2A约35%。将GB细胞（CT-2A-mCherry）植入小鼠大脑，并使用体内成像系统（IVIS）监测肿瘤植入。在肿瘤植入后第7天，小鼠颅内注射AAV8-GFP或PBS作为对照，然后在第14天处死小鼠，通过GFP基因表达水平来评估转导效率。与注射PBS对照的小鼠相比，注射AAV8-GFP的小鼠在肿瘤携带的左半球中GFP基因表达水平显著更高，而在非肿瘤的右半球中两组之间没有观察到显著差异。通过免疫荧光（IF）分析大脑以确定转基因表达，结果显示AAV8-GFP在肿瘤边缘显示出最高的转导率，但在AAV8-GFP转导的细胞中，GFP没有与GFAP阳性星形胶质细胞或IBA1阳性小胶质细胞共定位。然而，AAV8血清型并不仅仅靶向mCherry阳性的肿瘤细胞，此外，在少突胶质细胞和神经元中也观察到GFP表达。在肝脏、肺和脾脏中GFP表达水平很低，表明AAV载体主要被肝脏隔离，但AAV8-GFP的肝脏摄取较低，减少了AAV介导的肝毒性风险。对来自大脑的离散肿瘤组织进行流式细胞分析，mCherry阳性肿瘤细胞为13.4%，GFP阳性AAV8转导细胞为3.6%，mCherry阳性/GFP阳性双阳性细胞为3.4%。综上所述，AAV8血清型能够有效转导GB细胞系，并在体内模型中显示出较高的转导效率，尤其是在肿瘤边缘。此外，AAV8-GFP的生物分布表明其肝脏摄取较低，减少了潜在的肝毒性风险。

图3 小鼠GB细胞系中AAV8-GFP载体的转导谱

为了验证AAV8载体介导的SaCas9-KKH/sgRNA基因编辑mmu-miR-21a对胶质细胞瘤的治疗效果，研究人员生成了一个较小的232 cassette（约4.5 kb），编码SaCas9-KKH和sgRNA3，这些基因位于AAV载体的ITRs（倒置末端重复序列）之间。构建了两种质粒：包含SaCas9-KKH和sgRNA3的CMV-SaCas9-KKH-U6-sgRNA3（AAV8-CRISPR）和缺少sgRNA的CMV-SaCas9-KKH-U6（AAV8-control）。使用预包装的AAV8-CRISPR质粒体外转染CT-2A细胞，与AAV8-control相比，mmi-miR-21a-5p的表达水平显著降低。通过颅内注射将AAV载体与肿瘤细胞（CT-2A-FLuc-mCherry）同时注射到小鼠的肿瘤部位，以验证CRISPR基础编辑方法。与AAV8-control和未处理的CT-2A肿瘤携带大脑相比，接受AAV8-CRISPR治疗的肿瘤携带大脑中mmu-miR-21a-5p的表达水平降低了180倍。接受AAV8-CRISPR治疗的小鼠在第13天至第23天之间肿瘤生长受到抑制，并且在第20天和第23天肿瘤大小显著减小，中位总生存期显著增加，生存期增加了31%。另外，与AAV8-control相比，接受AAV8-CRISPR治疗的小鼠中肿瘤抑制基因Pten和Pdcd4显著上调。在肿瘤植入后第5天和第10天进行治疗的小鼠中未观察到治疗效果，表明这种治疗可能需要在特定的时间窗口内进行。通过Sanger测序和NGS确认了CRISPR诱导的mmu-miR-21a基因序列的插入和缺失。通过TUNEL染色和多种血液标记物分析评估AAV注射的局部和系统毒性，未观察到AAV8注射引起的局部或系统毒性。

图4 AAV8-CRISPR在携带胶质母细胞瘤小鼠实现基因组编辑

本文描述的策略在胶质瘤（GB）小鼠模型中显示出了减缓肿瘤生长和显著提高存活率的效果。这项研究不仅为胶质瘤的治疗提供了一种潜在的新疗法，而且展示了利用CRISPR-Cas9技术进行精确基因编辑在癌症治疗中的潜力，这对于未来癌症治疗策略的发展具有重要意义。