神经病理性疼痛（NP）全球患病率7%~10%，现有药物疗效有限。电压门控钠通道Nav1.7和Nav1.8是DRG神经元中与神经病理性疼痛密切相关的核心离子通道，但针对两种通道的单靶向药物效果不佳，提示二者可能存在病理协同机制。
近日，同济大学附属上海市第四人民医院彭长庚团队与空军军医大学解柔刚团队、大理大学于昕及上海市第一康复医院沈夏峰团队联合在期刊Advanced Science上发表了题为Targeting Supramolecular Active Complexes of Nav1.7/ Nav1.8 to Relieve Chronic Neuropathic Pain的论文，研究表明慢性NP的特征标志物—Nav1.7/Nav1.8/TrkB 超分子活性复合物（SMAC），其组装受TrkB/CREB 通路及与五种细胞骨架蛋白共同调控，SPTAN1和DSP是维持其结构与功能的核心分子。SMAC通过富集钠离子、放大钠电流，导致DRG神经元过度兴奋和反复放电，这是神经痛持续难治的根本原因，Nav1.7与Nav1.8双重阻断是针对该病的高效治疗方案，同时细胞骨架蛋白及TrkB-DSP互作位点可作为潜在新药靶点。
已有研究表明，miR-96敲除可诱发痛相关行为，并伴随Nav1.7与Nav1.8表达共同上调，提示神经损伤状态下，两种钠通道共表达的神经元比例可能发生重塑。本研究首先检测了坐骨神经分支损伤（SNI）模型小鼠背根神经节（DRG）中Nav1.7与Nav1.8的表达变化，60倍物镜成像显示，SNI术后2周共表达Nav1.7/Nav1.8的DRG神经元胞膜上出现聚集，6周时进一步形成Nav1.7/Nav1.8/TrkB SMAC，阳性神经元数量远多于假手术组，且主要分布于TrkB（酪氨酸激酶受体B）阳性神经元中（图1A–D），术后6周SMAC尺寸显著增大（图1E–G），并定位于神经元轴突根部，经Dil染色进一步验证（图1H、I），假手术组仅少量微小聚集体，提示其与术后愈合痛相关。
图1.神经损伤诱导小鼠GRD神经元形成 Nav1.7与Nav1.8 SMAC
借助60nm超分辨成像可见，SNI术后6周小鼠DRG神经元内的SMAC为Nav1.7、Nav1.8与TrkB共同构成的多边形柱状晶格结构，晶格边长160~250nm，各类蛋白分子相互连接，构成完整的簇状单元（图1J、K），随机光学重建显微镜（STORM）（20nm分辨率）观测，三种蛋白沿晶格长轴呈梯度分布，经测算，Nav1.7、Nav1.8平均分子密度分别为340个/μm³、902个/μm³，复合物核心区异源蛋白间距约30nm，同源蛋白间距约70nm，大量分子几乎相互贴近排布（图1L~N）。用Scn9HA/+小鼠（机械痛行为正常）证实，HA标签可高效标记Nav1.7阳性神经元，其标记的Nav1.7明确分布于SMAC中，且Nav1.7表达存在细胞异质性（图2A），Trk2A-Tomato/+报告小鼠示踪显示，SMAC主要形成于TrkB阳性低阈值机械感受器神经元中（图2B）。
图2.SNI小鼠DRG神经元SMAC中Nav1.7与TrkB的分布
与小鼠模型结果相符，臂丛撕脱（BPA）所致神经病理性疼痛患者DRG神经元普遍形成Nav1.7/Nav1.8/TrkB大型SMAC，正常组织未见该结构，复合物主要定位于细胞膜，广泛分布于30~120μm神经元中，其中直径＞60μm的大神经元占比超73%（图3A-C）。结构光照显微镜（SIM）成像证实人源SMAC同样为边长160~250nm的多边形晶格结构，由大量多边形簇组装而成，平均直径约2μm，部分簇仅含Nav1.8或TrkB；此类复合物也大量分布于DRG神经纤维上（图3D、F）。综上，Nav1.7/Nav1.8/TrkB SMAC可作为重度慢性神经病理性疼痛的特征性病理标志。
图3.BPA所致的NP患者DRG神经元中Nav1.7/Nav1.8/TrkB SMAC形成
基于SMAC中两种钠通道的协同致病作用，本研究开展药物干预实验。随着SNI术后SMAC的组装成熟（2~6周），Nav1.7阻滞剂（PF-05089771）与Nav1.8阻滞剂（PF-04885614）单独给药时镇痛效果逐渐下降，至6周时即使提高剂量也无法缓解机械性异常痛（图4A–E）。两药联用后协同效应显著，疗效优于单药及加巴喷丁（100mg/kg），且避免了加巴喷丁的镇静副作用（图4F–H）。换用另一种Nav1.8阻滞剂（PF-04531083）与PF-05089771联用，仍可维持协同作用，但Nav1.7阻滞剂GNE-0439联合PF-04885614无效；该协同效应在Scn9HA/+小鼠中也得到再次验证（图4I–M、）。24小时药效动态监测显示，术后2周单药或联用均有一定效果，但术后6周仅两药联用组能显著缓解疼痛（图4N–S）。
图4.联合抑制Nav1.7与Nav1.8可有效地缓解SNI模型小鼠机械性异常痛
为探究SMAC是否参与糖尿病性神经病理性疼痛，研究通过腹腔注射链脲佐菌素（STZ）构建糖尿病小鼠模型，末次给药2周后小鼠空腹血糖＞13mM，提示糖尿病模型构建成功（图5A）。形态学检测发现，正常小鼠DRG无典型SMAC结构，而STZ造模10周的糖尿病小鼠DRG神经元中可大量形成Nav1.7/Nav1.8/TrkB超分子活性复合物。行为学检测显示，小鼠自STZ给药4周起出现明显机械性异常痛，且疼痛症状可持续至造模10周（图5B、C）。药物干预结果表明，采用Nav1.7阻滞剂PF-05089771与Nav1.8阻滞剂PF-04885614联合干预，可在糖尿病疼痛早期（4周）和晚期（10周）显著缓解小鼠神经病理性疼痛，且联合镇痛效果显著优于单药治疗，存在明确协同镇痛效应（图5D–I）。
图5. Nav1.7与Nav1.8 SMAC参与小鼠糖尿病性神经病理性疼痛的发生
为明确TrkB对SMAC形成的调控作用，SNI术后第35天起，对小鼠连续7天给予TrkB激动剂（7,8-二羟基黄酮）或拮抗剂（ANA-12）（图6A–C）。结果显示，TrkB激动剂显著增加DRG中共表达Nav1.7/Nav1.8/TrkB的神经元数量，并增大SMAC面积和荧光密度；拮抗剂则相反，明显缩小SMAC面积、降低簇密度（图6D–J）。行为学方面，拮抗剂可部分缓解机械性疼痛；激动剂虽促进SMAC成熟并降低5/8小鼠的痛阈，但因模型痛阈基线过低，组间无统计学差异（图6K）。
图6.TrkB激活促进SMA形成
为筛选参与SMAC组装的蛋白，对SNI术后6周小鼠DRG进行Nav1.7/1.8亲和纯化及质谱分析，鉴定出多种种互作蛋白，选取SPTAN1、DSP、AHNAK、MPZ、PRX五种细胞骨架蛋白验证（图7A）。免疫染色显示，SNI小鼠DRG中五种蛋白均与Nav1.7共定位于SMAC，而假手术组仅见少量微小簇且无MPZ信号（图7B）。SIM成像证实五类蛋白形成多边形晶格，连接Nav1.7簇介导SMAC组装（图7C）。BPA损伤患者病变DRG结果一致，超分辨成像显示SPTAN1串联多个Nav1.7簇，STORM证实五种蛋白与Nav1.7高度混杂分布（图7D–F）。HEK293过表达实验表明，单种骨架蛋白可促进Nav1.7/1.8聚集，多蛋白共表达形成更大通道簇；两种SPTAN1亚型与Nav1.7完全共定位，DSP、PRX、MPZ为部分共定位；长链Nav1.7更易聚集（图7G–L）。体内敲低实验显示，于SNI术前5天向小鼠L4、L5节段DRG注射混合靶向病毒shRNA，可完全阻断疼痛发生，减少SMAC阳性神经元数量、缩小面积、降低分子密度（图8A–F、）。单独敲低SPTAN1或DSP可抑制SMAC并缓解疼痛；敲低AHNAK仅减少SMAC数量但不影响疼痛；敲低MPZ可提升痛阈（图8B–C）。长效监测显示，混合AAV-shRNA从术后2周至8周持续镇痛，不影响正常触觉与急性痛觉（图8G–I）。
图7.细胞骨架蛋白促进Nav1.7与Nav1.8聚集
图8.靶向细胞骨架蛋白可抑制SMAC形成并缓解神经病理性疼痛
利用分子对接（HADDOCK2.4）和邻近连接实验（PLA），在SNI术后6周小鼠DRG中检测钠通道与五种细胞骨架蛋白的直接相互作用。结果显示，Nav1.7和Nav1.8均可直接结合SPTAN1，Nav1.8还可结合PRX；DSP则分别与SPTAN1、AHNAK、MPZ相互作用（图9A、B）。SNI组细胞内PLA荧光信号显著多于假手术组，提示病理状态下蛋白互作增强（图9C）。据此构建SMAC组装模型：DSP作为核心枢纽，结合SPTAN1、AHNAK和MPZ形成基础骨架；SPTAN1招募Nav1.7和Nav1.8，同时Nav1.8结合PRX，协同完成SMAC组装。
图9. Nav1.7、Nav1.8与五种细胞骨架蛋白存在直接相互作用
研究发现五种细胞骨架蛋白中，Dsp、Sptan1、Prx、Ahnak四种基因的启动子区存在CREB结合位点。双荧光素酶报告实验证实，过表达CREB可显著增强这四种基因的启动子活性，突变结合位点后转录激活效应减弱或消失（图10A–E），提示BDNF/TrkB/CREB信号通路上调上述蛋白表达，促进SMAC形成。利用HADDOCK软件开展蛋白分子对接，预测TrkB与五种骨架蛋白的结合能力，结果显示TrkB与DSP亲和力最强（评分−131.0±22.2，结合界面间距<5Å）（图10F、G）。邻近连接实验（PLA）实验进一步验证：与假手术组相比，SNI术后2周、6周小鼠DRG中TrkB-DSP互作信号显著增多，提示病理状态下二者结合增强（图10H–N）。
图10.BDNF/TrkB/CREB信号通路激活四种细胞骨架蛋白的表达，且TrkB与DSP存在直接相互作用
全细胞膜片钳记录显示，SNI术后TrkB阳性低阈值机械感受神经元激活阈值降低，放电模式由单峰转为反复放电，且频率随时间升高（图11A–E）。术后2周，Nav1.7/1.8单药可抑制动作电位，联用效果更佳；术后6周单药耐受，仅联用仍能有效阻断反复放电且可逆（图11F–I）；人源病变DRG神经元结果一致（图11J–L）。电生理数据显示，联用使总钠电流下降71%；病变神经元持续性钠电流较正常升高2.7倍。正常神经元中，单药及联用对持续性钠电流的阻断率分别为54%（PF-05089771）、0%（PF-04885614）和62%；病变神经元中分别为65%、61%和91%（图11M–U）。提示SMAC中Nav1.7是持续性钠电流主要载体，Nav1.8参与调控，二者协同增强兴奋性，构成双靶点联用强效镇痛的分子基础。
图11.联合抑制Nav1.7与Nav1.8可阻断高兴奋性背根神经节神经元的动作电位
联合荧光离子指示剂、双光子成像与膜片钳技术显示，动作电位发生时SMAC区域电位变化异于其他区域，钠离子局部聚集、滞留，外流钠流可诱发二次动作电位，驱动反复放电（图12A–E）。联用Nav1.7/1.8阻滞剂可快速抑制钠内流并阻断二次放电，证实SMAC类似生物晶体管富集钠离子、放大钠电流（图12F、G）。TrkB激动剂可降低动作电位阈值与基强度，拮抗剂则相反，二者均不影响静息膜电位，提示TrkB协同钠通道调控兴奋性（图12H–M）。敲低五种骨架蛋白后，多数神经元难以诱发动作电位；单独敲低SPTAN1或DSP可升高放电阈值、降低振幅，各敲低处理均提升基强度（图12N–S）。综上，SMAC通过改变电生理特性加剧疼痛，SPTAN1与DSP是维持其结构与功能的关键骨架蛋白。
图12. Nav1.7/Nav1.8/TrkB SMAC调控神经元反复放电
本研究首次发现并证实了慢性神经病理性疼痛中Nav1.7/Nav1.8 SMAC的存在及其核心致病作用，为理解该病的深层机制提供了全新视角。基于此发现的Nav1.7/1.8双靶点阻断策略显示出优于现有药物的镇痛效果和安全性，并为后续First-in-Class小分子药物研发、临床联合用药提供了坚实的理论与实验依据。
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