胰腺炎内脏痛：中山大学徐婷团队揭示一条全新的脑-胰感觉传导通路

作者通过腹腔注射雨蛙素构建小鼠急性胰腺炎（AP）模型（图1A），结果显示，AP组血清淀粉酶显著高于生理盐水组且随给药天数上升（图1B）；AP组胰腺小叶间纤维间隔增厚水肿，伴淋巴细胞、中性粒细胞浸润（图1C），髓过氧化物酶（MPO）活性随给药次数升高（图1D）。检测发现，AP组胰腺组织三种关键炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA及蛋白表达均显著上调（图1E、1F）。行为学检测中，AP组扭体阳性反应增多（图1G），提示存在自发性内脏痛；0.02g和0.4g冯·弗雷纤维丝刺激下，AP组缩退反应差异显著（图1H、1I），故选取这两个参数用于后续实验。综上，AP诱导的内脏痛模型构建成功。因随给药天数增加小鼠状态变差，后续实验均采用造模3天的小鼠。

内脏感觉传导主要通过迷走神经与脊神经通路。用逆行示踪病毒注射胰腺标记胰腺支配神经元（图2A），结果显示结状神经节（NG）标记率为9.78±1.01%，背根神经节（DRG）标记率1.39%~8.91%，其中胸9段DRG最高（图2B-2D）。为验证示踪特异性，采用胰管灌注法，NG标记率12.10±1.83%，胸9段DRG最高。顺行示踪进一步证实，NG注射病毒后，胰腺腺泡及胰岛周边可见标记纤维。迷走神经是否介导内脏痛存在争议，此为研究核心。磷酸化细胞外信号调节激酶（pERK）是NG神经元激活标志物，cFos是中枢敏化指标。急性胰腺炎（AP）组小鼠NG的pERK、NTS的cFos信号均显著升高。双侧膈下迷走神经切断术（VGX）可显著降低二者信号（图2E、2F），并缓解AP小鼠痛觉行为（图2G-2H）。为了明确VGX对AP病理的影响，检测发现其可改善胰腺病理、血清淀粉酶、MPO活性及促炎因子表达。采用双病毒策略（图2I），特异性消融胰腺投射的NG神经元，可显著缓解AP小鼠内脏痛（图2J-2L）。综上，迷走神经在胰腺至大脑的内脏痛传导中起主导作用，NG→NTS轴为核心传导通路。

作者分析Kupari, J.等的数据集发现，NG细胞可聚类为17个亚群、两大集群，TRPV1特异性高表达于第二集群（NG12-NG18，占比更高）（图3A）；该集群特异性基因的GO分析显示其与痛觉感知相关（图3B）。据此推测NG的TRPV1⁺神经元介导急性胰腺炎内脏痛传入。免疫荧光共染色证实，胰腺注射逆行示踪病毒标记的NG神经元多为TRPV1阳性（图3C），且与AP诱导的pERK共定位。采用树脂毒素（RTX）清除双侧NG的TRPV1⁺神经元后，AP小鼠的机械刺激反应和扭体反应显著缓解（图3D、3E）。原代NG神经元电生理实验显示，AP中升高最显著的肿瘤坏死因子α（TNF-α）可降低神经元基强度电流、增加动作电位发放（图3F、3G），而TNF-α抑制剂SPD304可消除该效应（图3H），表明TNF-α可敏化NG神经元。

已有结果证实，炎症激活的迷走神经TRPV1神经元参与急性胰腺炎内脏痛传入，且NTS内cFos表达显著升高，切断迷走神经可逆转该痛觉反应与cFos激活。为明确NTS神经元激活是否由迷走神经TRPV1神经元介导，采用活性依赖示踪策略联合RV逆行示踪（图4A），鉴定出AP激活的NTS起始细胞（图4B），且这些神经元接收NG投射，NG内EGFP⁺信号为TRPV1神经元（图4C）。提示NTS激活神经元接收NG内TRPV1神经元传入；胰腺内检测到RV标记的EGFP⁺信号（图4D），证实提示胰腺与NTS之间存在从外周到中枢的神经环路。采用Gi‑DREADD化学遗传抑制胰腺→NG→NTS环路（图4E），结果显示抑制NG神经元活性可显著缓解AP小鼠内脏痛行为（图4F-4H）。

为了探究急性胰腺炎时NTS神经元活性变化，采用Fos-creERT2策略，将AAV-cFos-ERT2creERT2与AAV-DIO-GCaMP6s共注射至NTS，腹腔注射他莫昔芬与雨蛙素诱导AP（图5A）。结果显示，NTS多个切面有大量GCaMP6s标记神经元（图5B），对照组仅见少量激活。cFos染色验证病毒标记效率：70.8%的GCaMP6s⁺细胞为cFos⁺，62.1%的cFos⁺细胞为GCaMP6s⁺（图5C-5E）；光纤钙信号记录显示，雨蛙素处理后cFos⁺神经元活性显著升高（图5F）。采用Gi-DREADD抑制雨蛙素激活的cFos⁺神经元（图5G、5H），注射CNO后可显著缓解AP小鼠内脏痛（图5I-5J）。NTS含90%谷氨酸能（CaMKIIα⁺）和少量GABA能神经元，共染色显示GCaMP6s⁺神经元均与CaMKIIα共标（图5K-5L）。综上，NTS内谷氨酸能神经元激活介导AP内脏痛传入信号。

探究NTS^Glu神经元痛觉信号投射的高级脑区，将AAV-CaMKIIα-EGFP注入NTS绘制单突触投射图谱（图6A、6B）。示踪显示，其纤维末梢主要投射至下丘脑室旁核（PVN）、臂旁核（PB）、未定带（ZI）、丘脑室旁核（PVT）（图6C），均与痛觉感知相关。雨蛙素处理可显著上调PVN内cFos表达（图6D）。向NTS注射顺行病毒AAV2/1-hSyn-Cre、PVN注射Cre依赖型AAV-DIO-EGFP，21天后PVN可见NTS→PVN投射的绿色荧光。免疫荧光显示，EGFP信号与CaMKIIα大量共定位（图6E、6F）；神经元亚型：3.6%为GABA阳性、10.1%为OXT阳性、5.8%为AVP阳性。接受NTS^Glu投射的PVN谷氨酸能神经元在AP内脏痛中显著激活，提示PVN是NTS下游参与内脏痛加工的关键脑区。

为阐明NTS^Glu→PVN^Glu通路在胰腺内脏痛中的作用，开展环路特异性调控实验。将AAV2/1-CaMKIIα-Cre与AAV-DIO-hM3Dq混合注射至NTS，AAV-DIO-GCaMP6s注射至PVN并植入光纤（图7A），腹腔注射CNO后记录钙信号，hM3Dq组PVN^Glu神经元荧光强度显著高于对照组（图7B）。向NTS注射AAV2/1-CaMKIIα-Cre、PVN注射AAV-DIO-hM4Di-EGFP，腹腔给予CNO抑制该通路（图7C），可显著缓解AP诱导的内脏痛（图7D）。向NTS^Glu末梢注射编码eNpHR的病毒进行光遗传抑制（图7E），也获得类似镇痛效果（图7F）。采用多重逆行示踪验证通路连接：胰腺注射retro-AAV-hSyn-mCherry，PVN注射retro-AAV-CaMKIIα-Cre，NTS注射Cre依赖性辅助病毒，三周后注射RV-ENVA-ΔG-EGFP（图7G）。NTS和NG内红绿荧光共定位，证实胰腺-大脑环路存在（图7H）。综上，胰腺-大脑轴（胰腺→NG^TRPV1→NTS^Glu→PVN^Glu通路）介导AP后的内脏痛传入感知。