客户文章丨Adv. Sci.丨西安交大王云鹏/马现仓/魏曙光发现星形胶质细胞 PCBP1：调控铁死亡，改善抑郁样行为

慢性应激影响腹侧海马的铁死亡

为了探究慢性应激对vHip细胞的影响，采用慢性不可预测温和应激（CUMS）模型评估小鼠抑郁样行为。结果显示，CUMS组小鼠第3-8周体重显著下降，第4周起蔗糖偏好持续降低，悬尾测试（TST）和强迫游泳测试（FST）中不动潜伏期缩短、不动时间延长，成功诱导抑郁样表型；旷场测试（OFT）证实行为改变与运动功能损伤无关（图1a-e）。对两组小鼠vHip组织进行蛋白质组学与磷酸化蛋白质组学分析，CUMS组存在271种差异表达蛋白质（DEPs），其中上调157种、下调114种，凸显vHip蛋白质表达失调（图1f-g）。GO富集分析显示DEPs主要关联突触功能与核糖体活性；KEGG分析表明其参与谷氨酸能突触、神经退行性疾病、凋亡及铁死亡相关通路（图1h-j），其中谷氨酸能突触通路与抑郁症密切相关。免疫印迹验证显示，CUMS组GRIA1、GRIA3、谷氨酰胺合成酶（GS）、14-3-3γ、GPX4下调，DHCR7上调（图1k）。磷酸化蛋白质组学分析有效分组，CUMS组鉴定出345种上调、163种下调磷酸化蛋白质（图1l-n）。KEGG分析显示其富集于铁死亡、胞吞作用等通路，且铁死亡相关蛋白（PCBP1、PCBP2等）磷酸化水平下调（图1o）。综上，CUMS可诱导小鼠vHip产生铁死亡相关的蛋白质组学及磷酸化蛋白质组学特征，后续将进一步探究铁死亡调控vHip功能与抑郁样行为的潜在机制。

图1 慢性应激影响vHip中的铁死亡

慢性应激诱导vHip星形胶质细胞铁死亡及神经元损伤

为了验证vHip铁死亡通路与慢性应激诱导抑郁样行为的关联性，检测vHip铁死亡相关病理指标，结果显示慢性应激显著降低vHip谷胱甘肽（GSH）水平，升高丙二醛（MDA）和铁离子浓度，且活性氧（ROS）生成增加（图2a-b）。

免疫荧光染色表明，慢性应激仅导致vHip星形胶质细胞数量显著减少（图2c-d）。CUMS显著减少vHip中GPX4阳性细胞（尤其GPX4⁺-GFAP⁺星形胶质细胞），且DG、CA1、CA3亚区均呈一致趋势；星形胶质细胞形态异常（长度缩短、分支减少），线粒体出现皱缩、嵴减少等铁死亡典型特征（图2e-g）。透射电镜（TEM）和高尔基染色显示，CUMS组vHip突触密度、突触后致密区（PSD）厚度及树突棘数量（主要为分支型）显著降低，突触间隙和PSD长度无影响（图2h-i）。综上，慢性应激可诱导小鼠vHip星形胶质细胞铁死亡，并导致神经元突触损伤。

图2 慢性应激诱导vHip中星形胶质细胞铁死亡及神经元功能损伤

去铁胺通过抑制星形胶质细胞铁死亡改善抑郁样行为

为了验证vHip星形胶质细胞铁死亡与慢性应激抑郁样行为的关联，CUMS期间给小鼠施用铁死亡抑制剂DFO（甲磺酸去铁胺）（图3a）。DFO可逆转CUMS小鼠体重下降、恢复蔗糖偏好，改善TST/FST行为学指标（图3b-e），且不影响自发活动，证实抑制铁死亡可改善抑郁样行为。CUMS升高vHip中MDA、铁含量及ROS，降低GSH，DFO可逆转这些铁死亡相关指标异常（图3f-g）；同时恢复星形胶质细胞GPX4表达、修复细胞形态及线粒体完整性（图3h-k）。DFO还可逆转CUMS诱导的GS下调，恢复vHip谷氨酸水平至正常（图3l）；并修复突触损伤、阻止树突棘密度及分支型比例下降（图3m-n）。综上，DFO通过抑制铁死亡，缓解应激抑郁样行为，恢复星形胶质细胞功能并逆转vHip谷氨酸能神经毒性。

图3 去铁胺通过抑制星形胶质细胞铁死亡改善抑郁行为

星形胶质细胞GL261细胞铁死亡影响海马HT22细胞谷氨酸毒性

细胞外谷氨酸清除主要由星形胶质细胞调控，其功能障碍会导致谷氨酸清除受损、神经元功能缺陷甚至凋亡。本研究建立体外共培养模型（图4a），探究星形胶质细胞铁死亡对海马细胞谷氨酸清除及神经毒性的影响。CCK-8法检测显示，谷氨酸以时间依赖方式降低海马HT22细胞活力（图4b）。与星形胶质细胞GL261细胞共培养可显著降低谷氨酸对HT22细胞的毒性（活力升高、乳酸脱氢酶LDH降低，图4c-d），并挽救谷氨酸诱导的突触标志物PSD95、SYN下调，提示神经毒性减弱（图4e）。向GL261细胞施用铁死亡诱导剂erastin（依拉司汀），其以剂量-时间依赖方式降低GL261活力（图4f）。谷氨酰胺合成酶（GS）是谷氨酸代谢关键酶，erastin可显著降低GL261细胞GS活性，DFO可挽救该效应（图4g），且erastin处理会完全消除GL261对HT22细胞的谷氨酸毒性保护作用（图4h-i）。综上，星形胶质细胞GL261铁死亡会加剧海马HT22细胞的谷氨酸毒性。

图4 星形胶质细胞GL261中的铁死亡影响海马HT22细胞中的谷氨酸毒性

PCBP1调控星形胶质细胞铁死亡敏感性及亚阈值应激易感性

将靶向PCBP1（shP1）或PCBP2（shP2）的shRNA质粒转染GL261细胞，经10μM erastin处理12h后检测活力及ROS水平（图5a）。结果显示，单独敲低PCBP1/2对细胞活力和ROS无影响；但敲低PCBP1（而非PCBP2）显著加剧erastin诱导的细胞死亡并升高ROS（图5b-c），且转染后相应蛋白表达特异性降低（图5d），erastin处理后各组GPX4表达无差异。C8-D1A星形胶质细胞中重复实验结果一致，提示体外敲低PCBP1增强星形胶质细胞对铁死亡的敏感性。

采用亚阈值CUMS（sCUMS）模型探究vHip星形胶质细胞PCBP1敲低对小鼠抑郁样行为的作用。sCUMS前3周，向小鼠vHip双侧注射星形胶质细胞特异性PCBP1 shRNA腺相关病毒（AAV）（图5e），结果证实eGFP⁺星形胶质细胞中PCBP1有效敲低（图5f-g）。sCUMS结束后评估抑郁样行为：单独敲低PCBP1不影响体重，sCUMS显著降低小鼠体重（图5h）；shPCBP1联合sCUMS组小鼠抑郁样行为明显（图5i-k）。铁死亡标志物检测发现单独sCUMS或PCBP1敲低不影响GPX4⁺星形胶质细胞比例及GSH、MDA水平；但二者联合显著降低星形胶质细胞GPX4表达（图5l），降低GSH并升高MDA。综上，PCBP1调控星形胶质细胞对铁死亡的敏感性及小鼠对亚阈值应激的易感性。

图5 PCBP1负责调控星形胶质细胞铁死亡的敏感性及对阈下应激的易感性

星形胶质细胞PCBP1改善慢性应激诱导的抑郁样行为

用慢病毒感染星形胶质细胞GL261介导PCBP1过表达，经erastin孵育12小时（图6a）。结果显示，过表达PCBP1可保护GL261细胞免受erastin诱导的细胞死亡，并降低ROS水平（图6b-d），可上调erastin处理组的GPX4表达。这些结果表明，体外上调PCBP1可保护星形胶质细胞免受erastin诱导的铁死亡。

在CUMS处理前3周，向小鼠vHip双侧注射星形胶质细胞特异性过表达PCBP1的腺相关病毒（AAV）（图6e）。过表达PCBP1可显著升高CUMS暴露小鼠的蔗糖偏好（图6f-i）；显著延长CUMS组小鼠TST和FST的不动潜伏期，缩短不动时间（图6j-k）。

为进一步验证星形胶质细胞过表达PCBP1在体内对铁死亡和谷氨酸稳态的影响，检测了铁死亡标志物及谷氨酸代谢相关关键蛋白，结果显示过表达PCBP1显著逆转CUMS诱导的GPX4阳性星形胶质细胞比例降低，恢复GSH水平，减轻MDA蓄积（图6l–n）；逆转CUMS诱导的GPX4、GLT1和GS表达下调，而谷氨酸-天冬氨酸转运体（GLAST）表达无显著变化（图6o）；同时，显著降低谷氨酸含量（图6p）。为了明确PCBP1是否通过调控谷氨酸稳态发挥抗抑郁作用，在行为学测试前3小时向vHip注射GS抑制剂MSO。结果显示MSO处理完全逆转了过表达PCBP1对CUMS小鼠的行为改善效应，表现为蔗糖偏好显著降低（图6s），TST和FST的不动时间显著延长（图6t-u），且达到CUMS对照组水平。这些结果表明PCBP1的抗抑郁效应通过调控vHip星形胶质细胞的谷氨酸稳态介导。综上，这些结果表明，星形胶质细胞PCBP1上调可有效抑制铁死亡、恢复谷氨酸稳态，并改善CUMS诱导的抑郁样行为。

      图6 星形胶质细胞PCBP1可保护星形胶质细胞免受铁死亡，并改善慢性应激诱导的抑郁样行为

星形胶质细胞PCBP1增强谷氨酸能神经元活性及神经生理学功能

基于此前星形胶质细胞GL261铁死亡加剧海马HT22细胞谷氨酸毒性的结果，探究星形胶质细胞PCBP1介导的铁死亡抑制是否缓解慢性应激诱导的vHip神经元功能损伤。最后一次FST后，神经元活性标志物c-Fos免疫染色结果显示，强迫游泳诱导Ctrl组vHip c-Fos高表达，CUMS组则降低；c-Fos与CaMKII阳性细胞共定位比例显著下降（图7a），提示应激应答差异主要由谷氨酸能兴奋性神经元介导。在vHip星形胶质细胞过表达PCBP1，采用钙成像GCaMP6s记录CUMS小鼠TST、FST期间神经元活性（图7b-c）。免疫染色显示，PCBP1过表达可增加CUMS小鼠vHip c-Fos阳性细胞总数及其在谷氨酸能神经元中的比例（图7d-e）。TST期间记录显示小鼠挣扎活跃期（高钙信号）与被动不动期（低钙信号）交替出现（图7f）；CUMS组随机挣扎后6秒内钙信号强度显著低于Ctrl组，而PCBP1过表达组小鼠钙信号模式与Ctrl组相似（图7g），提示PCBP1过表达可挽救CUMS诱导的vHip谷氨酸能神经元钙活性降低。

采用谷氨酸探针iGluSnFR探究PCBP1对vHip谷氨酸水平的调控（图7b、h），结果显示CUMS组在TST（图7i、j）和FST中谷氨酸事件频率增加、AUC增大、衰减时间延长；PCBP1过表达可将这些异常恢复至Ctrl组水平。vHip脑片全细胞膜片钳记录显示（图7k），CUMS显著降低谷氨酸能神经元mEPSC频率（图7l）和诱发动作电位发放率（图7m），而星形胶质细胞PCBP1过表达可逆转这些损伤。综上，星形胶质细胞过表达PCBP1可有效逆转慢性应激诱导的vHip谷氨酸能神经元低活性及谷氨酸调控异常。

图7 星形胶质细胞PCBP1增强谷氨酸能神经元活动及神经生理学功能

PCBP1调控星形胶质细胞铁死亡敏感性的潜在机制

为了探究PCBP1调控星形胶质细胞铁死亡的机制，将shPCBP1质粒转染GL261细胞沉默PCBP1后进行转录组学分析。数据分析显示差异表达基因（DEGs）富集于凋亡、铁死亡及氧化应激相关通路，提示敲低PCBP1影响多细胞通路（图8a-c）。将3093个DEGs与661个铁死亡相关基因（源自FerrDB、KEGG、AmiGO2数据库）交叉比对，鉴定出122个重叠DEGs（图8d）。GO分析显示其富集于氧化应激、铁离子稳态等相关术语（图8e），提示下调PCBP1破坏星形胶质细胞铁平衡与氧化应激状态。KEGG分析表明其富集于铁死亡、HIF-1信号通路等（图8f），核心通路相互作用网络凸显Sat1、Acsl4、Gpx4等铁死亡相关DEGs（图8g）。对122个铁死亡相关DEGs进行蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）分析（图8h），Il6、Slc11a2、Hmox1、Gpx4等9个关键枢纽基因连接性显著，在网络中起核心作用。

已知PCBP1可结合基因启动子区富含胞嘧啶基序调控转录。利用MEME套件在枢纽基因上游1kb区域筛选出5个显著富集的PCBP1结合基序（图8i），TomTom工具验证其与已知PCBP1结合基序显著匹配（图8j）。综上，PCBP1通过调控氧化应激和铁稳态相关基因调节铁死亡敏感性，在铁死亡通路中起关键作用。通过RNA免疫沉淀-定量PCR（RIP-qPCR）验证PCBP1对铁死亡相关靶点的直接调控：12个选定基因中11个在PCBP1免疫沉淀复合物中显著富集（图8k），琼脂糖凝胶电泳验证PCR产物（图8l）。PCBP1敲低/过表达分析显示，仅Ftl呈一致双向调控（PCBP1沉默时下调，PCBP1过表达时上调，图8m）。siRNA介导敲低Ftl、Fth、Slc11a2（图8n、o），erastin处理后，敲低Ftl或Fth显著增强铁死亡敏感性（细胞死亡增加、ROS升高），Slc11a2敲低无效应（图8p、q）；各组GPX4表达均显著降低（图8r）。综上，Ftl是PCBP1调控星形胶质细胞铁死亡敏感性的主要功能下游靶点。

图8 PCBP1调控星形胶质细胞铁死亡敏感性的潜在机制

总   结

星形胶质细胞PCBP1通过抑制铁死亡、维持谷氨酸稳态，保护vHip谷氨酸能神经元，改善应激诱导的抑郁样行为，PCBP1是抑郁症潜在治疗靶点。