N⁶-甲基腺苷（m⁶A）是大脑中主要的可逆mRNA修饰，通过 “写入蛋白”、“擦除蛋白”和 “读取蛋白”调控mRNA运输、定位及翻译，对学习记忆至关重要。YTHDF家族中，YTHDF2通过招募不同复合体加速m⁶A修饰mRNA降解。但YTHDF2介导的mRNA降解在学习记忆中的具体作用及机制尚不明确，此前仅发现海马齿状回（DG）特异性敲除YTHDF2会损害记忆，而全海马区域的作用仍待探究。
2025年9月17日，中国科学院深圳先进技术研究院周涛、浙江大学医学院附属邵逸夫医院崔一卉、南方科技大学深圳市人民医院李宽共同通讯在Advanced Science 上发表题为“Enhanced Protein Synthesis and Hippocampus-Dependent Memory via Inhibition of YTHDF2-Mediated m6A mRNA Degradation”的研究论文。通过构建前脑特异性YTHDF2条件性敲除（DF2-CKO）小鼠模型，结合行为学、电生理、分子生物学等实验，发现 YTHDF2 缺失会抑制m⁶A修饰mRNA的降解，使突触功能相关靶mRNA（如SEMA4B）稳定性增强，进而提升海马神经元兴奋性突触传递、树突棘密度及活性依赖性蛋白质合成，最终增强海马依赖性学习记忆；而在成年DF2-CKO鼠海马区重新表达YTHDF2或敲低其下游靶标SEMA4B，可逆转上述记忆增强表型，证实YTHDF2是海马依赖性学习记忆的负调控因子，为认知相关疾病研究提供新方向。
已有研究显示YTHDF2在小鼠大脑和不同细胞类型中均有高表达，包括神经元、神经胶质细胞等。免疫染色证实成年小鼠海马区存在YTHDF2蛋白，且主要与神经元标志物NeuN共定位，与星形胶质细胞标志物GFAP共定位少（图1A）。鉴于YTHDF2或参与学习记忆，研究通过杂交YTHDF2 flox/flox小鼠与Emx1-Cre小鼠，构建前脑特异性YTHDF2条件性敲除（DF2-CKO）小鼠模型。免疫染色、蛋白质印迹及RNA测序证实，DF2-CKO组海马区和内侧前额叶皮层（mPFC）YTHDF2有效敲除，且YTHDF2第四个外显子缺失（图1B）。DF2-CKO小鼠存活繁殖正常，成年后体重、脑体积与对照组无差异（图1C-D）。皮层和海马结构检测（SATB2、CTIP2、NeuN、GFAP免疫染色）及不同时期海马细胞增殖评估（BrdU、Ki67标记）显示，两组无显著差异，表明YTHDF2缺失不影响前脑正常发育。转棒、旷场等行为学实验也证实，两组小鼠运动能力、焦虑样行为无差异。
但DF2-CKO小鼠学习记忆能力增强：经典恐惧条件反射实验（图1E）中，中等强度训练下，对照组与DF2-CKO组小鼠恐惧学习僵住曲线相似（图1F），但DF2-CKO组训练后1小时海马依赖性情境恐惧记忆增强，24小时更显著，听觉恐惧记忆不受影响（图1G-J）；雌性小鼠训练后24小时情境恐惧记忆也增强，且两组旷场行为无差异。巴恩斯迷宫实验（图1K-N）进一步证实，DF2-CKO组找到目标位置时间短、在目标象限停留时间长（图1M-N），空间记忆（海马特异性功能）增强。综上，小鼠前脑条件性敲除YTHDF2可增强海马区学习记忆形成，且不影响前脑整体发育。
图1 DF2-CKO小鼠的增强学习和记忆
海马突触可塑性是空间学习记忆的基础细胞机制，研究通过对海马CA1锥体细胞全细胞膜片钳记录，探究恐惧学习中YTHDF2缺失对海马突触功能的影响。研究先检测对照组与DF2-CKO组小鼠海马脑片基础突触传递：在未受刺激（naïve）状态下，DF2-CKO组CA1锥体细胞自发性兴奋性突触后电流（sEPSCs）频率升高（图2A-C），自发性抑制性突触后电流（sIPSCs）无变化，提示其兴奋性突触传递选择性增强。为探究突触前功能，刺激CA3-CA1通路并记录CA1锥体细胞反应：DF2-CKO组无论基础状态还是训练后，配对脉冲比率（PPR）均显著降低，提示突触前释放概率升高。稀疏标记形态学分析显示，DF2-CKO组CA1神经元树突棘密度增加（图2D-E），且中等强度恐惧训练后仍维持（图2D-E），与突触增强一致且表明兴奋性突触增多。恐惧训练后24小时，DF2-CKO组sEPSCs频率、振幅进一步增强（图2F-I），抑制性传递无影响，说明恐惧学习可在YTHDF2缺失的CA1神经元中诱导额外突触增强。
鉴于DF2-CKO组情境记忆增强，研究对CA1神经元记录长时程增强（LTP）：稳定记录eEPSC基线10分钟后，对CA3-CA1突触施加高频刺激（HFS）诱导LTP，naïve状态下两组LTP强度相当（图2J）。验证发现，训练后神经元经10分钟短时程增强（STP）无法维持LTP（图2K）；不同刺激强度（0-100μA）输入-输出（I-O）曲线显示，DF2-CKO组基础水平诱发兴奋性突触后电流高于对照组，训练后差异扩大（图2L），表明YTHDF2缺失促进CA1神经元恐惧学习诱导的突触增强。综上，YTHDF2缺失直接增强海马神经元兴奋性突触传递、促进突触可塑性，提示YTHDF2是海马依赖性学习记忆的负调控因子。
图2 DF2-CKO小鼠海马神经元兴奋性突触传递和树突棘密度增加
为了验证空间学习记忆改善是否由海马区YTHDF2特异性缺失导致，研究探究成年DF2-CKO小鼠海马区重新引入YTHDF2能否逆转该表型。研究将携带FLAG标签YTHDF2的腺相关病毒（AAV-YTHDF2）或对照GFP病毒（AAV-GFP），立体定位注射至小鼠双侧海马（图3A）。病毒成功在海马CA1-CA3、DG亚区恢复YTHDF2表达（图3B），蛋白恢复水平约为对照组的80%（图3C）。恐惧条件反射实验中，DF2-CKO小鼠海马重新表达YTHDF2后，训练后1小时、24小时情境恐惧记忆几乎恢复至对照水平，对听觉恐惧记忆（图3D-H）、旷场及明暗箱实验中的运动活性与焦虑水平无影响。对照组小鼠海马过表达YTHDF2，会损害短期、长期情境恐惧记忆（图3E、G），不影响听觉恐惧记忆（图3F、H），印证YTHDF2是海马学习记忆负调控因子。
此外，全细胞膜片钳记录显示，恐惧学习后重新表达YTHDF2，显著降低sEPSCs频率与振幅（图3I-L），对sIPSCs无影响；还降低CA1锥体细胞I-O曲线幅度，逆转PPR变化（图3M-N）。LTP实验中，中等强度训练后，DF2-CKO小鼠中原本被掩盖的HFS诱导型LTP，经YTHDF2重新表达完全恢复（图3O）。综上，YTHDF2通过选择性抑制兴奋性突触传递，负调控学习记忆。
图3 在成年海马体中重新表达YTHDF2逆转记忆性能
YTHDF2是m⁶A甲基化读取蛋白，可促进m⁶A修饰靶mRNA降解。为明确其在学习记忆中的作用，研究通过RNA免疫沉淀测序（RIP-seq，研究RNA与蛋白质相互作用的高通量测序技术）定位YTHDF2结合靶转录本，RNA-seq评估其在海马区的表达。RIP-seq两生物学重复样本重复性高，鉴定出2964个YTHDF2靶mRNA（图4A），其中1989个在恐惧条件反射后RNA-seq中被检测到（图4B）。GO功能注释显示，这些靶mRNA显著富集于突触组装、组织及突触膜相关过程（图4C），与DF2-CKO小鼠记忆和突触可塑性变化一致。结果显示，基础水平下YTHDF2敲低样本中，靶mRNA丰度显著高于非靶mRNA（图4D）；恐惧条件反射后该趋势仍明显（图4E）。且RNA-seq中，DF2-CKO小鼠多数YTHDF2靶标差异表达基因（DEG）上调，非靶标上调DEG比例低。
通过放线菌素D（ActD，抑制转录）处理原代培养海马神经元，分析不同时间点RNA-seq数据以研究mRNA半衰期。结果显示，DF2-CKO神经元中YTHDF2靶mRNA半衰期较对照组延长（图4F），且比非靶mRNA更长（图4G）。这些半衰期延长的靶mRNA，GO富集分析也显示其富集于突触相关过程。逆转录实时荧光定量PCR（RT-qPCR，用于基因表达差异分析）进一步验证了Bdnf、Grin2b等部分突触功能相关基因半衰期延长。此外，mRNA上m⁶A交联免疫沉淀测序（CLIP-seq，研究RNA与蛋白质相互作用的高通量测序技术）峰数量与YTHDF2 RIP样本中RNA富集程度正相关（图4H），表明mRNA m⁶A修饰峰越多，其在YTHDF2 RIP-seq中丰度越高。综上，YTHDF2在介导突触功能相关m⁶A修饰mRNA降解中起关键作用，其缺失增强靶mRNA稳定性，可能是DF2-CKO小鼠学习记忆提升的原因之一。
图4 YTHDF2的缺失增强了突触功能相关靶mRNA的稳定性
为了探究YTHDF2缺失致靶mRNA稳定性升高是否引发蛋白表达变化，对基础状态及恐惧训练后的DF2-CKO与对照小鼠海马组织进行蛋白质组学分析（研究蛋白质的表达水平，翻译后的修饰，蛋白与蛋白相互作用等）。结果显示，基础状态下YTHDF2靶标蛋白丰与对照小鼠海马组织进行蛋白质组学分析。结果显示，基础状态下YTHDF2靶标蛋白丰度无差异，恐惧训练后DF2-CKO组靶标蛋白丰度显著升高（图5A-B），提示蛋白质合成对学习刺激存在动态调控。为明确YTHDF2敲除后的翻译调控机制，在原代培养海马神经元中开展体外翻译表面传感（SUnSET）实验（研究蛋白质翻译后修饰对基因表达的影响），排除非神经细胞干扰。结果表明，氯化钾（KCl）处理即去极化后DF2-CKO组神经元嘌呤霉素掺入量高于对照组，基础状态下无差异（图5C），说明其蛋白质合成增强依赖去极化。恐惧训练后海马核糖体图谱分析（研究细胞内正在翻译的mRNA）发现，DF2-CKO小鼠翻译效率（TE）升高（图5D），且TE上调转录本多于下调转录本（图5E），提示学习刺激后其翻译增强更显著。
恐惧训练后海马蛋白质组学分析鉴定出191个差异表达蛋白（DEP），100个上调、91个下调。富集分析显示，上调蛋白富集于蛋白质加工、高尔基体囊泡运输及折叠相关过程（图5F），与蛋白质合成增强一致。鉴于局部蛋白质合成对突触结构功能变化的关键作用，且半数YTHDF2靶标（m⁶A修饰mRNA）定位于突触区室，选取Grin2B、SEMA4B探究突触区室蛋白质合成。恐惧训练后4小时分离海马PSD组分发现，GluN2B（Grin2B编码蛋白）在PSD中水平升高、总蛋白无变化（图5G），SEMA4B在PSD及总蛋白中均升高（图5H），与蛋白质组学结果一致。综上，DF2-CKO小鼠海马区学习刺激诱导的蛋白质合成在突触区室中更明显。
图5 在DF2-CKO小鼠海马体中活动依赖性蛋白合成增强
DF2-CKO小鼠情境恐惧记忆与兴奋性突触传递增强，源于YTHDF2靶标转录本丰度及翻译水平升高，故探究敲低这些靶标能否逆转该表型。验证显示，YTHDF2 RIP样本中4类信号素家族成员SEMA4B mRNA富集（图6A-B），YTHDF2敲除后其mRNA降解延迟（图6C）；甲基化RNA免疫沉淀定量聚合酶链反应（MeRIP-qPCR）证实SEMA4B在m⁶A免疫沉淀样本中富集（图6D），与突触区域SEMA4B存在9个m⁶A修饰位点的研究一致。提出假设：干扰SEMA4B表达可逆转DF2-CKO小鼠记忆增强表型。构建AAV-shRNA-SEMA4B并注射至DF2-CKO小鼠海马区，Western blot证实SEMA4B表达降低约30%（图6E）。结果显示，敲低对照组小鼠SEMA4B会损害其情境恐惧记忆（图6G、I），表明SEMA4B直接参与记忆形成；DF2-CKO小鼠敲低SEMA4B后，训练后1小时、24小时情境恐惧记忆增强被逆转（图6G-J），注射对照病毒的DF2-CKO小鼠仍保持高恐惧记忆。
全细胞膜片钳记录显示，DF2-CKO小鼠敲低SEMA4B后，CA1锥体细胞sEPSCs频率与振幅显著降低（图6K-M），抑制性突触传递无影响（图6N-P），与SEMA4B RNAi降低mEPSCs频率和振幅的研究一致。综上，SEMA4B是未被发现的学习记忆调控因子，下调SEMA4B可使DF2-CKO小鼠增强的记忆与兴奋性突触传递恢复正常，揭示YTHDF2通过调控突触可塑性相关基因mRNA稳定性调控记忆的机制。
图6 敲除SEMA4B逆转了DF2-CKO小鼠的表型
本文首次明确YTHDF2在全海马区学习记忆中的负调控作用，揭示 “YTHDF2-m⁶A-mRNA（SEMA4B 等）-突触传递-记忆” 的调控轴。此外，为理解学习认知的分子基础提供新视角，为记忆障碍等认知疾病的干预（如抑制 YTHDF2或调节其靶基因）提供潜在靶点。
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