客户文章︱Neuron︱美国UNC宋娟团队合作发现AD认知与情感缺陷“分治”新靶点

SuM中不同的神经元亚群

已知SuM主要向DG发出投射，但投射至dDG与vDG的SuM神经元是否为具有独特生理、分子特征的亚群尚不明确。为此，作者采用双色荧光狂犬病病毒（RV）跨单突触逆行示踪技术，以Calb1-Cre小鼠DG颗粒细胞（GC）为起始细胞，向dDG、vDG分别注射RV-eGFP与RV-mCherry标记单突触输入（图1A-1C）。结果显示，SuM-dDG与SuM-vDG神经元高度不重叠，仅2.78%标记细胞共表达两种荧光蛋白（图1D-1G）。为了验证该解剖学连接差异，用结合不同荧光团的霍乱毒素B亚基（CTB）分别注射dDG、vDG进行逆行示踪。结果与RV示踪一致，CTB标记的SuM-dDG（红色）与SuM-vDG（绿色）神经元在SuM内混杂但重叠极少，证实二者为解剖学上的不同亚群。

随后，向dDG、vDG分别递送AAV2-retro-tdTomato或AAV2-retro-eGFP标记目标神经元，通过离体脑片记录评估其电生理特性（图1H-I）。发现SuM-dDG与SuM-vDG神经元电生理特性存在差异，相较于SuM-dDG，SuM-vDG神经元内在兴奋性显著更高（图1J-K），静息膜电位（RMP）更去极化（图1L），提示二者电生理特性不同。

图1 SuM-dDG和SuM-vDG神经元在解剖学上是分离的并表现出不同的电生理特性

为了探究SuM-dDG与SuM-vDG神经元的分子差异，作者开展单核RNA测序（snRNA-seq）与膜片钳测序（Patch-seq），向小鼠dDG/vDG注射AAV2-retro-eGFP后，解剖SuM并通过10×Genomics平台进行snRNA-seq（图2A），捕获19106个细胞核转录组，经无监督聚类鉴定出7类主要细胞。聚焦神经元，按转录谱将其分为12个亚群（图2B-C），部分亚群表达SuM富集标记基因。因SuM体积小且邻近其他核团，将神经元聚类映射到高分辨率下丘脑图谱以区分核心群体，SuM-vDG小鼠的4个eGFP标记细胞均映射至SuM核心聚类C1（图2D）。通过Seurat工具（应用于scRNA-seq/snRNA-seq数据分析）映射到10×参考数据集，85.7% SuM-dDG神经元归为C4，83.3% SuM-vDG神经元归为C1（图2E-F）。差异表达分析鉴定出326个显著富集基因（图2I）。基因集富集显示SuM-vDG神经元富集内在兴奋性及膜电位调控相关通路（图2G）：SuM-dDG高表达抑制兴奋性的基因Cnr1，SuM-vDG高表达促去极化的Scn2a等（图2H），与电生理观察（SuM-vDG兴奋性高、RMP更去极化，图1J-1L）一致。GO分析证实两群体功能差异（图2J）：SuM-dDG表达学习记忆相关基因（如Trim67、Cnr1），SuM-vDG表达焦虑抑郁相关基因（如Tac1，图2K）。综上，SuM-dDG与SuM-vDG神经元具有独特分子特征。

图2 SuM-dDG和SuM-vDG神经元表现出不同的分子特征

接下来，作者研究了两个SuM亚群的输入与输出连接。绘制单突触输入图谱时，将AAV2-retro-Cre注射到dDG或vDG，同时向SuM注射编码TVA和狂犬病病毒糖蛋白的Cre依赖型辅助病毒，再注射EnvA假型RV（图3A）。结果显示，SuM-dDG接收外侧下丘脑（LH）输入更多，SuM-vDG优先接受后下丘脑（PH）支配（图3B、3C）。绘制输出连接图谱时，向dDG或vDG递送AAV2-retro-Cre，向SuM注射表达膜靶向GFP和突触定位mRuby的Cre依赖型AAV-FLEX-mGFP-T2A-Synaptophysin-mRuby（图3D）。该系统中，绿色标轴突、红色标突触前末梢，仅定量重叠（黄色）信号以减少假阳性。定量全脑分支模式发现，两亚群主要靶向对应DG区域（图3E-F），SuM-dDG与dDG突触连接远多于vDG，SuM-vDG优先靶向vDG；二者均投射至海马CA1/2/3，但突触数少；向海马外区域（如MS、HDB）投射无显著差异，提示存在投射偏好性。综上，通过单核RNA测序、膜片钳测序、狂犬病病毒示踪及投射图谱绘制等方法，证实SuM-dDG与SuM-vDG是分子和功能上截然不同的亚群，在电生理特性、基因表达及输入/输出连接模式上均有差异。

图3 SuM-dDG和SuM-vDG神经元表现出不同的输入和输出连接

不同的SuM亚群差异性参与认知与情感功能调控

为了探究SuM-dDG与SuM-vDG神经元是否分别参与认知、情感功能，作者用光纤钙成像技术，在海马依赖行为（空间记忆的新颖位置识别实验NPR实验、抑郁评估的悬尾实验TST实验）中，记录表达GCaMP6f的两SuM亚群群体钙活动（图4A）。NPR实验中，SuM-dDG神经元在记忆提取阶段活动较编码阶段显著增强（图4B-4I、4M）；TST实验中，从静止转活动时，SuM-vDG神经元活动显著增强（图4J-4L、4N）。结果表明，SuM-dDG与SuM-vDG神经元分别差异性参与认知、情感功能调控。

图4 SuM亚群在认知和情感功能中具有不同的差异

不同的SuM亚群是认知与情感行为的选择性必需群体

明确SuM亚群对认知、情感功能的独特作用后，作者通过化学遗传学方法选择性抑制SuM-dDG/SuM-vDG神经元（图5A、5D），并以c-Fos标记验证抑制效果（图5B、5C、5E、5F）。抑制SuM-dDG后，小鼠NPR实验辨别率降低（图5G、5H）、CFC实验情境A冻结时间缩短（图5I-J），且运动能力未受影响（图5L），提示记忆受损。抑制SuM-vDG后，小鼠旷场中央停留时间减少（图5K-5M）、高架零迷宫开放臂停留时间减少（图5N、5O）、TST不动时间增加（图5P），提示焦虑/抑郁样行为加剧。结果表明，SuM-dDG活动是认知功能必需，SuM-vDG活动是情感功能必需，二者具有选择性。

图5 不同的SuM亚群被选择性地用于认知和情感行为

SuM-dDG与SuM-vDG通路选择性调控认知与情感行为

为了探究两类SuM神经元活动是否足以调控认知与情感功能，作者通过光遗传学激活其投射通路，向SuM递送表达CaMKII-ChR2-YFP的AAV，在dDG/vDG上方植入光纤，激活通路后进行行为学测试（图6A-B）。认知行为测试中，记忆提取阶段激活SuM-dDG通路，小鼠NPR实验辨别率升高（图6C），CFC实验中24小时、7天情境A冻结时间延长（情境B无变化，图6D-6F）。情感行为测试中，激活SuM-vDG通路，小鼠高架零迷宫开放臂停留时间增加（图6I），TST、FST不动时间减少（图6J-K），SPT蔗糖偏好百分比升高（图6L），提示焦虑/抑郁样行为及快感缺乏缓解。此外，激活两通路均未改变小鼠运动能力及旷场中央停留时间（图6G-H）。综上，SuM-dDG与SuM-vDG通路分别选择性调控认知与情感功能。

图6 SuM-dDG或SuM-vDG投射的光遗传学激活选择性地调节记忆和情感行为

AD小鼠在行为过程中表现出DG投射SuM神经元的异常活动

为了评估在体活动，作者用光纤钙成像记录SuM-dDG与SuM-vDG神经元的钙动力学。基线条件下（饲养笼内），5×FAD（AD模型）小鼠两类神经元钙活动均显著低于WT小鼠（图7A-7J）。进一步探究AD小鼠认知/情感任务中神经元的行为特异性异常，在NPR（图7A）与TST（图7B）中监测钙活动：NPR提取阶段，AD小鼠SuM-dDG活动显著低于WT（图7K-7M），SuM-vDG无变化（图7N-7P）；TST中，AD小鼠SuM-vDG在“静止→活动”转换时活动增强减弱（与抑郁样行为相关，图7Q-7S），SuM-dDG无异常（图7T-7V）。综上，AD模型小鼠中SuM-dDG与SuM-vDG存在内在特性异常及基线活动降低，且行为相关活动表现出独特异常模式。

图7 AD小鼠中DG投射SuM神经元表现出异常活性

光遗传学激活SuM-dDG或SuM-vDG通路可选择性改善AD模型小鼠的认知与情感缺陷

因AD模型小鼠SuM-DG神经元基线及行为诱导性活动低，作者采用与WT小鼠相似的光遗传学策略，在其行为学测试时激活SuM-dDG/SuM-vDG通路（图8A-B），探索缺陷改善作用。激活SuM-dDG通路（记忆提取阶段），AD小鼠NPR实验辨别率升高（图8C），CFC实验情境A（非情境B）冻结时间恢复至WT水平（图8D-8F），记忆改善；且不影响旷场、高架零迷宫、TST、FST及SPT表现（图8G-8L），提示其选择性改善记忆缺陷。激活SuM-vDG通路，AD小鼠高架零迷宫开放臂停留时间增加（图8I），TST/FST不动时间减少，SPT蔗糖偏好度恢复至WT水平（图8J-8L），焦虑/抑郁样行为缓解；且不影响记忆表现（图8C-8F）及旷场运动与中央停留时间（图8G-H），提示其选择性改善情感缺陷。综上，激活SuM-dDG与SuM-vDG通路可分别选择性改善AD模型小鼠的认知与情感缺陷。

图8 光遗传学激活SuM-dDG/vDG通路选择性地挽救AD小鼠的认知和情感缺陷

总   结

本文首次证明SuM-DG亚环路平行调控认知与情感，揭示AD多症状的环路机制，打破“单一通路调控多症状” 的传统认知。SuM因无AD病理沉积，成为理想治疗靶点，可通过靶向激活SuM-dDG/SuM-vDG，分别改善AD患者的认知或情感缺陷。