IF15.7丨Nat. Commun.丨南方科技大学王子龙团队发现吗啡致痒的分子机制：NPY⁺神经元去抑制驱动GRP⁺神经元激活

研究表明抑制性神经元上的MOR通过去抑制作用介导吗啡诱导的瘙痒。经RNAscope原位杂交检测，脊髓背角（SDH）中38.27%的Oprm1⁺（MOR基因名）中间神经元表达Npy，29.96%的NPY⁺中间神经元表达Oprm1（图1A-B），说明抑制性中间神经元的Oprm1在SDH的NPY⁺中间神经元中显著表达。化学遗传学激活脊髓NPY⁺中间神经元（鞘内注射CNO）后，NpyCre;hM3Dq小鼠的鞘内注射吗啡诱导瘙痒反应及啃咬舔舐行为均消失（图1C），表明NPY⁺中间神经元参与该过程。构建Oprm1条件性敲除小鼠（NpyCre;Oprm1fl/fl），该小鼠接受不同剂量吗啡后，搔抓及啃咬舔舐行为完全消失（图1D）。用内吗啡肽-1（EM-1，一种MOR选择性内源性配体））来评估NPY⁺中间神经元上的MOR是否介导内源性阿片诱导的瘙痒，野生型小鼠中EM-1引发剂量依赖性短期搔抓（图1E），而NPY⁺中间神经元Oprm1敲除小鼠的EM-1诱导瘙痒消失（图1F，），说明NPY⁺中间神经元上的MOR介导内、外源性MOR激动剂诱发的瘙痒。

用NpyCre;Ai9 tdTomato报告小鼠来标记NPY⁺中间神经元，离体电生理记录显示，10μM吗啡在17/34个SDH Ⅰ-Ⅱ层NPY⁺中间神经元中诱发外向电流（指正电荷从细胞内流向细胞外的离子流动，其核心意义在于降低神经元的兴奋性）（图2A-B），抑制9/22个SDH Ⅱ层NPY⁺中间神经元的动作电位，增加其基强度（诱发动作电位所需的最小电流）（图2C-F）。相比之下，溶媒灌流无影响（图2G-I）。这些结果表明吗啡通过MOR降低NPY⁺中间神经元兴奋性，可能进一步对瘙痒环路产生去抑制作用并引发瘙痒反应。

基于NPY和NPY1受体（NPY/NPY1R）系统在瘙痒传递中的已知作用，研究测试了NPY对鞘内注射吗啡诱导瘙痒的直接调控作用。联合注射NPY以剂量依赖方式显著减弱吗啡诱导的搔抓或啃咬行为（图3A）。不同剂量的NPY1R特异性激动剂LP-NPY也能抑制这些行为（图3B）。NPY1R选择性拮抗剂BIBO3304可完全阻断LP-NPY对吗啡诱导瘙痒的影响（图3C），且在Npy1r敲除（Npy1r⁻/⁻）小鼠中，NPY无法减轻吗啡诱导的瘙痒（图3D），证实了作用的特异性。这些数据表明NPY⁺神经元可能通过释放NPY对瘙痒环路发挥抑制作用，但Npy1r⁻/⁻小鼠无明显自发性瘙痒，可能因存在代偿机制。此外，鞘内注射NPY和LP-NPY均显著抑制内源性阿片EM-1诱导的瘙痒（图3E-F），表明NPY通过NPY1R直接调控阿片诱导的瘙痒反应。

研究表达MOR的NPY⁺中间神经元去抑制后激活的下游瘙痒相关神经元类型发现，鞘内注射吗啡可显著激活胃泌素释放肽Grp⁺和胃泌素释放肽受体Grpr⁺神经元（图4A、D）。具体而言，吗啡使SDH中Grp⁺神经元的c-Fos阳性神经元数量显著增加（图4B），而同时注射NPY则使其显著减少（图4B）。生理盐水组SDH Ⅱ层Grp标记细胞中c-Fos阳性占比4.35%，吗啡处理组增至18.59%（图4C），同时注射NPY后降至5.28%（图4C）。SDH Ⅰ-Ⅱ层Grpr⁺神经元的c-Fos阳性神经元数量在吗啡处理后显著增加（图4E），吗啡加NPY处理后显著减少（图4E）。吗啡处理后，SDH中Grpr标记细胞的c-Fos阳性比例从6.73%增至16.46%（图4F）。为确定NPY⁺中间神经元的直接下游神经元类型，向NpyCre小鼠SDH（T13-L1水平）注射Cre依赖的mWGA顺行示踪病毒，显示mWGA-mCherry信号在NPY⁺和GRP⁺中间神经元中表达，GRPR⁺中少量表达，表明NPY⁺向GRP⁺提供突触输入（图4G-J）。因mWGA可跨多突触传递，GRPR⁺中的mWGA可能是跨两突触或少数直接连接所致。用HSV顺行示踪和RV逆行示踪进一步证实突触连接，在NpyCre小鼠腰脊髓表达AAV辅助病毒（rAAV-hSyn-DIO-EGFP-T2A-Her2CT9和rAAVUL26.5-DIO-gD）后注射HSV-mCherry，RNAscope显示Grp⁺中间神经元中有mCherry阳性神经元（图4K-L）；向GrpCre小鼠SDH注射AAV辅助病毒（rAAV-EF1α-DIO-EGFPT2A-TVA和rAAV-EF1α-DIO-N2cG）14天后注射RV示踪病毒，双标证实病毒特异性感染，结合Npy RNAscope，证实NPY⁺和GRP⁺中间神经元存在解剖学连接（图4M-N）。这些数据表明，GRP⁺中间神经元是NPY⁺中间神经元的直接下游，二者有单突触连接。

脊髓背角（SDH）Ⅱ层的RNAscope实验显示，Npy1r与Grp的mRNA共定位率极高，66.93%的Npy1r⁺中间神经元表达Grp，66.44%的Grp⁺中间神经元表达Npy1r（图5A-B）。为明确GRP⁺中间神经元在吗啡诱导瘙痒中的作用，对GrpCre;iDTR小鼠腹腔注射白喉毒素（DTX）消融GRP⁺中间神经元，RNAscope证实其数量显著减少，行为学显示吗啡诱导瘙痒显著减轻（图5C）。用GrpCre;hM4Di小鼠化学遗传抑制GRP⁺中间神经元，经CNO处理后，吗啡诱导的瘙痒及啃咬舔舐行为均显著受抑（图5D），表明GRP⁺中间神经元是必需的。构建GRP条件性敲除小鼠（Vglut2Cre;Grpfl/fl），发现兴奋性中间神经元中敲除Grp后，吗啡诱导瘙痒显著减少（图5E）。鞘内注射GRPR拮抗剂PD176252（10μg）显著抑制吗啡诱导瘙痒（图5F），提示GRPR是GRP⁺中间神经元的下游信号。综上，吗啡诱导的瘙痒需要GRP⁺中间神经元及GRP参与。

为探究GRP⁺中间神经元是否接收来自表达MOR的NPY⁺中间神经元的抑制性输入，利用 GrpCre;Ai9 小鼠，对吗啡对Ⅰ-Ⅱ层GRP⁺中间神经元自发性抑制性突触后电流（sIPSCs）的影响开展了电生理学分析。记录数据显示，灌流10μM吗啡可显著降低sIPSCs的频率和振幅（图6A-D），这与吗啡作用于NPY⁺神经元输入端的突触前MOR的预期结果一致。BIBO3304未改变吗啡对sIPSCs的抑制作用，吗啡的抑制机制独立于 NPY1R信号通路。此外，在存在 0.5μM 河豚毒素（TTX）的情况下，10μM吗啡也显著降低了微型IPSCs的频率和振幅（图 6G-I）。吗啡对 GRP⁺神经元记录到的自发性兴奋性突触后电流（sEPSC）无显著影响。但吗啡在26%的GRP⁺神经元中诱发了外向电流。这些结果表明，吗啡特异性抑制GRP⁺神经元记录到的sIPSCs，这提示GABA/甘氨酸参与了该抑制性环路。通过GrpCre;GCamp6f小鼠的在体光纤光度记录（图6J-K）发现，吗啡注射后GRP⁺中间神经元显著激活，且与搔抓反应相关（图6K）。同时注射MOR拮抗剂纳洛酮或NPY可阻断吗啡对GRP⁺中间神经元的激活（图6K）。

此外研究NPY对GRP⁺中间神经元兴奋性的直接影响发现，10μM NPY使脊髓背角Ⅱ层GRP⁺中间神经元的基强度显著增加，电流注射诱发的动作电位数量减少（图7A-C），而溶媒灌流无影响（图7D-F）。此外，10μM NPY在脊髓背角Ⅱ层GRP⁺中间神经元中诱发平均振幅18.785pA的外向电流，且该电流可被2μM NPY1R选择性拮抗剂BIBO3304阻断（图7G）。测试NPY对GRP⁺中间神经元激活诱导的搔抓行为的影响显示，用10nmol CNO化学遗传学激活GrpCre;hM3Dq小鼠的GRP⁺中间神经元会引发强烈瘙痒，而鞘内注射10μg NPY可完全消除该瘙痒（图7H）。这些结果表明，NPY可直接抑制GRP⁺中间神经元的兴奋性，进而抑制其介导的瘙痒。

阿片类药物（如吗啡）通过作用于脊髓背角NPY⁺抑制性中间神经元上的MOR，抑制其兴奋性，减少对GRP⁺神经元的抑制性输入，导致GRP⁺神经元去抑制，进而激活GRPR⁺神经元，触发瘙痒反应。NPY-NPY1R系统在调节GRP⁺神经元活动中起关键作用，GRP-GRPR微环路的去抑制是阿片诱导瘙痒的核心机制。