在神经科学研究中，精准靶向特定神经元类型一直是解析复杂神经环路功能的关键挑战。近日，两项发表于《Neuron》的研究分别开发了针对纹状体和皮层中间神经元的增强子 AAV 工具，为神经环路研究和神经疾病治疗提供了强大的新手段。
Furlanis等人开发了一套增强子AAV工具盒，可特异性靶向和操控小鼠及非人灵长类动物大脑中的GABA能皮层神经元主要类型和亚型以及纹状体胆碱能细胞，通过单细胞基因组数据分析鉴定增强子候选，构建的工具经多条件下的解剖学、形态学和电生理学表征验证有效，能用于标记、观察活动和光遗传操控，且增强子序列在物种间保守，为研究神经回路和功能及开发精准靶向治疗提供了有力工具。
利用Dlx5a-Cre::INTACT小鼠分离皮层和纹状体GFP+细胞核，进行单细胞ATAC-seq，通过COSG算法鉴定细胞类型特异性增强子候选。将候选增强子克隆到rAAV载体，驱动dTomato、GCaMP6f或ChR2等表达，包装PHP.eB血清型以穿越血脑屏障。通过立体定向（STX）、脑室内（ICV）和眶后注射（RO）注射到不同年龄小鼠，3周后通过免疫组化、原位杂交、电生理记录等评估特异性和敏感性。
将工具应用于非人灵长类（恒河猴）和人类脑切片，评估保守性和功能。非人灵长类中，BiPVe3、BiPVe4等增强子驱动的标记细胞与小鼠中具有相似形态和电生理特性，如PV+细胞的快棘放电模式。人类脑切片中BiVIPe4增强子仍能特异性靶向VIP细胞。
图1 识别和表征具有细胞类型特异性的增强子AAV工具的策略
| 种特异性增强子表征
由Hunker、Wirthlin等人开发的增强子AAV工具包，该工具包可精准靶向啮齿类动物和灵长类动物纹状体中的主要神经元群体，包括中等棘神经元（MSNs）、直接通路（D1 MSN）和间接通路（D2 MSN）、Sst-Chodl、Pvalb-Pthlh和胆碱能中间神经元等，且增强子活性在啮齿类动物和灵长类动物中具有保守性，能通过多种病毒递送途径和携带不同转基因货物实现细胞类型特异性标记、光遗传扰动和多重标记等应用，为纹状体细胞类型和回路研究以及新型AAV基因治疗方法的开发提供了有力工具。
从人类Brain Open Chromatin Atlas（BOCA）和小鼠Cis-element Atlas（CATlas）等公开的ATAC-seq数据中，选择靠近纹状体细胞类型标记基因的候选增强子序列，克隆到AAV载体中，上游连接最小启动子和SYFP2荧光报告基因，用血脑屏障穿透性衣壳PHP.eB包装，RO注射到C57Bl6/J小鼠体内，3-5周后分析表达情况。最终筛选出48个具有良好活性的增强子，覆盖主要纹状体神经元群体，包括20个pan-MSN增强子、5个D1 MSN增强子、7个D2 MSN增强子、5个Sst-Chodl中间神经元增强子、7个胆碱能中间神经元增强子和4个Pvalb-Pthlh中间神经元增强子。
测试了立体定向（STX）、脑室内（ICV）和眶后注射（RO）三种注射途径对增强子特异性的影响。结果显示：RO注射的特异性最高，STX注射最低，ICV注射介于中间。例如，胆碱能增强子AiE0873m_3xC2的特异性在RO注射时为94%，ICV注射时为88%，STX注射时降至50%。但scRNA-seq分析显示，部分增强子如D1 MSN增强子AiE0779m在不同途径下仍保持100%的D1 MSN特异性。
图2 假定增强子驱动纹状体细胞类型特异性表达
| 特异性增强子表征
这两套工具突破了传统转基因模型的局限性，为解析神经环路功能、开发神经退行性疾病基因疗法提供了精准工具。后续研究可进一步探索增强子组合使用策略，以及在神经疾病模型中的治疗潜力。
原文链接
纹状体工具：
https://doi.org/10.1016/j.neuron.2025.04.035
皮层工具：
https://doi.org/10.1016/j.neuron.2025.05.002
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