重组腺相关病毒（rAAV）已被广泛用做神经环路研究的示踪工具及基因治疗给药载体，种类繁多的血清型赋予其多样的组织靶向感染特性，究其机制源于AAV衣壳蛋白和细胞表面受体互作的差异，因此，根据实验需求选用恰当的血清型是满足特定外源基因递送需求的重要保证。
AAV13以其在CNS内的有限的扩散范围而闻名，使其成为在小核团脑区进行精确标记和给药的理想载体。然而，AAV13介导的靶基因表达水平有待进一步提高。为了解决这个问题，中科院深圳先进技术研究院徐富强/林坤章团队对AAV13进行了升级改造，并于2024年6月份在《Zoological Research》上发表了题为“Engineered AAV13 Variants with Enhanced Transduction and Confined Spread”的研究论文，报道了基于13型AAV改造而获得了两个优异的突变体，分别命名为AAV13-587-7m8和AAV13-585-7m8，与AAV13相比，AAV13-587-7m8和AAV13-585-7m8对C57BL/6小鼠中枢神经系统的转导效率更高，其中，AAV13-587-7m8感染仍保留有限的扩散范围。这些改造的AAV13突变体能精准地将外源基因分别递送到小核团脑区或者较大核团脑区，因此非常适合作为脑实质内精准原位标记工具，在基因治疗和神经科学研究中具有很好的应用潜力。
AAV13突变体增强原位基因表达
首先，在初级感觉皮层（SSp）分别注射AAV13-CMV-EGFP及其突变体，可见其表现出局限的扩散范围如图1所示，脑片1/6裁图可见仅有原位感染的一小簇神经元细胞群呈现出绿色荧光。AAV13-587-7m8与AAV13-585-7m8相较于AAV13，增强了绿色荧光蛋白基因表达强度，AAV13-587-7m8维持了与AAV13相似的扩散范围，AAV13-585-7m8相对AAV13有更大的扩散范围，两种突变体可用于不同体积脑区的基因递送。
图1 AAV13突变体高效原位转导初级感觉皮层
其次，为了评估AAV13突变体在皮层下脑区基因递送效果，将AAV13及其突变体分别等量注射在中脑腹侧被盖区（VTA），如图2所示，结果与皮层注射相似，AAV13-587-7m8与AAV13-585-7m8相较于AAV13，增强了绿色荧光蛋白基因表达强度，AAV13-587-7m8维持了与AAV13相似的扩散范围，AAV13-585-7m8相对AAV13有更大的扩散范围，进一步证明了这两种突变体可用于不同体积脑区的基因递送。
AAV13突变体实现低剂量高效转导
上述SSp脑区与VTA脑区注射结果显示AAV13-587-7m8可以用于小范围脑区基因的高效转导，为了评估低剂量AAV13-587-7m8的转导性能，我们将AAV13与AAV13-587-7m8的注射剂量从200 nL降低至50 nL，分别注射至初级运动皮层（Mop），如图3A-C所示，注射剂量降低后，AAV13转导细胞数量有限但介导的荧光表达强度很弱，而AAV13-587-7m8在维持有限扩散范围的同时依然介导较强的荧光表达强度。为了进一步评估AAV13-585-7m8降低剂量后转导效果能否与剂量不变的AAV13-587-7m8相抗衡，我们将AAV13-585-7m8病毒滴度稀释两倍，AAV13-587-7m8滴度不变，各取200 nL注射至初级感觉皮层（SSp）,如图3D-G所示，AAV13-585-7m8降低剂量后扩散范围依然较大且介导的平均荧光强度弱于AAV13-587-7m8。AAV13-587-7m8可用于稀疏标记
应用AAV13-587-7m8携载Cre重组酶，并以AAV13-cre为对照，使用双病毒标记策略（AAV13-587-7m8-Cre和AAV9-CAG-DIO-EGFP）可实现精准位点的神经元稀疏标记, AAV-Cre作为“控制子”，将报告蛋白的表达锁定在局限的一小簇神经元细胞群，通过稀释滴度控制感染神经元的稀疏度，从而实现“精准稀疏”，配合AAV9-DIO-EGFP等“放大子”的高强度荧光表达，从而实现“高亮标记”（图4A、图4B）。相同稀释倍数下AAV13-587-7m8标记到更多神经元，说明AAV13-587-7m8进一步稀释也能达到与AAV13相似的稀疏标记效果。图4 基于双病毒策略的稀疏标记
总结
这些研究工作证实了对AAV13进行衣壳蛋白改造获得的两种突变体AAV13-587-7m8和AAV13-585-7m8可作为新型原位基因递送载体，相较于AAV13，两种突变体均增强了外源基因表达强度，分别适用于小核团脑区与较大核团脑区的基因递送。此外，AAV13-587-7m8也可用于神经元的高亮稀疏标记，用于分析神经元的精细结构。针对两个不同位点工程改造获得不同性能的具体机制，还需进一步的发掘探究。
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