rAAV（重组腺相关病毒）非常适合眼部基因治疗。眼睛的免疫特权环境结合rAAV的低免疫原性，不会引发强烈的先天免疫反应，降低了不良免疫反应的风险。此外，rAAV能够靶向广泛的视网膜细胞，包括光感受器、视网膜色素上皮（RPE）和节细胞，目前已经开发出各种AAV衣壳以优化特定细胞类型的转导。AAV1、AAV2、AAV5和AAV8血清型均可有效转染光感受器和视网膜色素上皮细胞。AAV2是眼科基因治疗中研究和应用最广泛的血清型之一，在许多临床试验中被成功用作载体，包括针对Leber先天性黑蒙（LCA）和脉络膜病变的试验。其他常用的血清型包括AAV5和AAV8，每种都提供了独特的优势。AAV5-hRKp.RPGR的眼底注射是安全的、耐受性良好，并改善了携带XLRP-RPGR的男性患者的视网膜敏感性和功能性视力。AAV8可以通过眼底注射给药，比AAV2更能有效地转导光感受器。
在眼科治疗中，rAAV（重组腺相关病毒）可以通过三种常见的给药途径来传递到视网膜：视网膜下注射（subretinal injection）、玻璃体腔注射（intravitreal injection）和脉络膜上注射（suprachoroidal injections）。
图1 AAV眼部基因治疗注射示意图【1】
实例一
AAV传递的光感受细胞特异性CRISPR/Cas9系统【2】
血清型：AAV8
启动子：RK（human rhodopsin kinase promoter）
实验动物：Nrl-L-EGFP小鼠，2周龄
注射方案：视网膜下注射，表达10周
实验结果：AAV-CRISPR/Cas9系统的敲低效率是使用增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因作为目标进行评估的。将AAV8（AAV-sgRNA-EGFP）与AAV-Cas9混合注射到2周大的Nrl-L-EGFP小鼠，视网膜下注射2.5×10^9 vg/eye AAV-Cas9和2.5×10^9 vg/eye AAV-sgRNA-EGFP。估计被sgRNA转导的杆细胞中有43%被成功敲除了EGFP基因。其余57%细胞未能被敲除EGFP的原因可能是缺乏Cas9表达、框内插入缺失无法消除EGFP表达和/或小鼠体内存在多个EGFP基因拷贝超出CRISPR介导基因消除的能力。
图2 AAV-CRISPR/Cas9在小鼠视网膜中抑制EGFP
实例二
CaMKII的重新激活可以保护RGC免受兴奋性毒性或轴突损伤【3】
血清型：AAV2
启动子：mSncg（mouse g-synuclein promoter），CAG
实验动物：C57BL/6小鼠，8周龄
注射方案：玻璃体腔注射，表达2周
实验结果：为了研究增强CaMKII的活性是否足以保护RGCs免受兴奋毒性或轴突损伤，在损伤开始前2周通过玻璃体腔注射AAV2（AAV-CaMKIIa T286D，滴度2×10^13 vg/ml），介导CaMKII突变基因在RGCs中表达。AAV2可有效转导95%以上的视网膜神经节细胞（RGCs），结果显示在RGCs中CaMKIIa T286D突变体的表达水平是内源性CaMKII的60%，CaMKIIa T286D突变体对RGC具有很强的保护作用。在小鼠损伤和疾病模型中，通过AAV基因治疗重新激活CaMKII活性可以保护RGCs，并保留视觉功能。
图3 AAV介导RGCs基因转导
实例三
TASK-3介导的非图像形成行为和图像形成行为【4】
血清型：AAV2
启动子：NEFL（the RGC-specific promoter Ple345）
实验动物：TASK-3 KO小鼠
注射方案：玻璃体腔注射，2×10^10 vg/eye，表达3周
实验结果：为了检测RGCs中的TASK-3通道是否足以维持PLR的敏感性，使用病毒载体和RGC特异性启动子在TASK-3 KO小鼠的RGCs中过表达TASK-3通道。包装生产出AAV2-Ple345（NEFL）-kcnk9-HA（AAV2-TASK-3）和AAV2-Ple345（NEFL）-EGFP（AAV2- control），并通过玻璃体腔注射到TASK-3 KO小鼠的双眼，3周后检测其表达特异性。结果显示TASK-3在RGC中特异性表达，接受TASK-3过表达的TASK-3 KO小鼠与接受对照病毒注射的TASK-3 KO小鼠相比，PLR的敏感性增强。
图4 AAV介导TASK-3在RGCs中过表达
实例四
高效跨物种眼部基因传递AAV病毒【5】
血清型：AAVv128
启动子：CMV
实验动物：食蟹猴
注射方案：脉络膜上注射，2×10^10 vg/eye，表达3周
实验结果：通过脉络膜上注射评估了AAV8和AAVv128- eGFP载体在NHPs中的视网膜转导效率，在注射后第14天可检测到eGFP的表达。通过扫描激光检眼镜（SLO）对动物进行体内视网膜荧光成像，以检测eGFP的表达，然后进行免疫荧光分析。通过食蟹猴脉络膜上注射AAV，剂量为3.5×10^12 vg/eye时，荧光成像显示，使用AAVv128载体时外周血眼底的eGFP荧光显著增加。
图5 NHPs眼内注射评价AAV8和AAVv128的转导效果
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参考文献
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