在当今社会，肥胖和糖尿病等代谢性疾病已成为全球性健康难题。胰高血糖素样肽-1受体（GLP-1R）是一种在体内广泛表达的肽类激素受体，参与能量调节和葡萄糖稳态的维持，与肥胖和糖尿病等密切相关。GLP-1R还是临床上一些减肥药物（如塞美格鲁肽和利拉鲁肽）的靶点。然而，尽管GLP-1R在临床上具有重要作用，目前用于高时空分辨率下研究GLP-1R激活动态的工具依然非常有限。
2023年6月2日，苏黎世大学的研究人员在 eLife 杂志在线发表了题为“Optical tools for visualizing and controlling human GLP-1 receptor activation with high spatiotemporal resolution”的论文。该研究开发了一种基因编码的传感器GLPLight1，具有高灵敏度（最大ΔF/F0=528%）和时间分辨率（τON=4.7秒），能够实时、高时空分辨率地响应GLP-1信号，并监测人类胰高血糖素样肽-1受体（GLP-1R）的激活动态。
研究人员基于人源胰高血糖素样肽-1受体（hmGLP1R）进行设计，在hmGLP1R的第三个细胞内环（ICL3）中的K336和T343位氨基酸之间插入环形排列的绿色荧光蛋白（cpGFP），开发出初代GLP1荧光探针，但其对GLP-1荧光响应较弱。随后，研究者对该探针进行了系列优化，具体包括：1）去除内源性GLP1R N端分泌序列（第1-23位氨基酸）；2）在探针C末端引入了内质网输出序列，以进一步增强膜表达；3）在第二胞内环（ICL2）及cpGFP 附近的两个受体残基进行L260K、K336Y、T343N突变，提升对GLP-1的荧光响应；4）突变C末端负责GLP1R内化的八个磷酸化位点，以减少探针蛋白的内化。最终，经过优化，获得了具有良好膜表达、高灵敏度（最大ΔF/F0=528%）和良好时间分辨率（τON=4.7秒）的GLP1荧光探针——GLPLight1，并筛选出一个具有良好的膜表达但对GLP-1无荧光响应的突变体（L141A, N300A, E387A），作为对照探针——GLPLight-ctr。
为进一步探究GLPLight1的表达及荧光响应特性，研究者利用腺相关病毒（AAV）在原代皮质神经元和293T细胞中进行体外表达。结果显示GLPLight1在细胞膜上表达良好，并且在原代皮质神经元细胞中对GLP-1显示出最大荧光响应456%（10 µM）。随后，研究者在HEK细胞中测量了GLPLight1荧光探针的光谱特性，发现其最大激发波长为500 nm，最大发射波长为512 nm。
图1 GLPLight1的结构及光学特性
此外，研究者通过荧光素酶互补测定等方法，对GLPLight1探针与内源GLP1R对下游信号传导特性进行了比较。结果显示，GLPLight1对多种G蛋白（如miniGs、miniGq、miniGi）耦合作用显著降低；在高浓度的GLP-1（100 nM）作用下，虽然GLPLight1表现出强荧光响应，但下游的cAMP水平未增加，表明GLPLight1并不参与cAMP信号通路的激活。由此表明，GLPLight1可做为一个实时监测GLP-1R激活状态的有效工具，而不会受到信号传导过程中其他因素的干扰，同时也不会影响正常的信号传导途径。
GLPLight1是一种基因编码的荧光探针，不仅对GLP-1具有高度灵敏的响应，还能模拟内源hmGLP1R受体在配体激活下的状态，具有广泛的应用潜力，特别是在在药物开发领域。研究者对GLPLight1进行了系列体外药理学实验，通过在不同条件下添加对GLP1R具有药理学效应的各种配体，表征其药理学特性。Exendin-9（Ex-9）是一种已知的GLP1R肽拮抗剂，在体外表达GLPLight1的HEK293T细胞中添加1.0 µM GLP-1后，再添加10 µM Ex-9，结果显示Ex-9能在不到5分钟的时间内将信号部分逆转至最大GLP-1反应的42%（图2a-b）。利拉鲁肽和塞美格鲁肽是已知的GLP1R激动剂，并作为临床抗肥胖药物使用。实验表明，在HEK293T细胞中，GLPLight1对这两种激动剂的响应与GLP-1相当，几乎达到了最大激活（图2a）（图2a）。以上结果表明，GLPLight1可作为直接检测药物对hmGLP1R药理作用的工具。此外，关于GLPLight1对其他肽类的特异性研究显示GLPLight1不响应GLP-2及其他内源性B1类GPCR肽类（GIP、CRF、PTH、PACAP或VIP）。
图2 293T细胞中GLPLight1药理学特性
为进一步验证GLPLight1是否能灵敏检测体外内源性GLP-1的释放，研究者人员将GLUTag细胞（一种能够分泌GLP-1/胰高血糖素的永生化肠内分泌细胞系）和HEK293T细胞（表达GLPLight1）进行共培养，然后再加入外源GLP-1。结果显示，与单独培养HEK293T细胞的对照组相比，HEK293T细胞与GLUTag细胞共培养时，GLPLight1对GLP-1的反应显著降低，表明 GLPLight1被GLUTag细胞分泌的内源性GLP-1预先激活。此结果表明，GLPLight1能够有效检测内源性GLP-1的释放，因此可作为一种潜在的筛选工具，用于研究在体外调控肠内分泌细胞（ECs）释放GLP-1的内在和外在因素。
图3 GLPLight1检测细胞内源性胰高血糖素样肽- 1 ( GLP-1 )的释放
接着，研究人员使用GLPLight1建立了一个全光学检测方法，用于体外表征photo-GLP1，探究光学控制GLP1R激活的可行性。photo-GLP1是一种新型的光敏GLP-1衍生物，通过在GLP1肽链N端添加光笼分子（photocaging Molecule）构建而成，在LED光（λ=370 nm，0.64 mW/mm2）下进行20分钟的照射可产生野生型GLP1。研究结果发现，增加10s紫外光（405 nm）照射后，GLP1正常表达，GLPLight1的荧光明显增加，且更长时间的紫外光照射（100s）会导致更高程度的GLPLight1反应，表明GLP1可以成功解笼并在细胞上激活GLPLight1传感器。
研究人员发现GLPLight1传感器对GLP-1的反应速度受到photo-GLP1存在的影响，photo-GLP1的存在显著降低了传感器激活的速度。这表明photo-GLP1可能通过与GLP1R的细胞外域结合来影响其激活动力学。研究人员进一步利用GLPLight1探究了photo-GLP1解笼后GLP1R激活的空间信息，发现GLPLight1能够以高空间分辨率检测到GLP-1的反应，并且这种反应可以局限于细胞膜的特定区域。最后，通过使用cAMP荧光探针G-Flamp1，研究人员证实了解笼photo-GLP1可以控制hmGLP1R激活后的功能性信号传导，实现了对GLP1R信号传导激活的高时空分辨率的光学控制。以上结果显示GLPLight1对GLP-1衍生物的响应与天然受体相似，同时也证明了光学控制GLP1R激活的可行性。
图4 photo-GLP1解笼后对细胞内信号传导的影响
此研究开发了一种基因编码的传感器GLPLight1，具有高灵敏度和时间分辨率，能够实时、高时空分辨率地响应GLP-1信号，并监测人类胰高血糖素样肽-1受体（GLP-1R）的激活动态。这为深入理解GLP-1/胰高血糖素/GLP1R信号系统在生理学中的作用，或促进针对GLP1R通路的药物筛选与开发提供了重要工具。
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