神经环路

• Q1: 转基因动物的Cre-loxP系统基因重组的优缺点各有哪些？
  A：转基因动物依赖的基因重组能够实现高效且特意的基因重组，但由于转基因动物难易获得、动物交配需要大量耗时（至少2代交配才能获得基因敲除动物）且区域或组织特异性不高（仅依赖启动子调控）。
• Q2: 分析辣根过氧化物酶（HRP）示踪方法结果时有哪些问题需要注意？

  A：

  （1）有效注射范围：HRP的注射范围从注射中心向周围扩散，浓度递减。其注射区的有效范围是难以确定的问题，故影响对结果的分析。一般认为注射中心深染而不能辩明其结构的区域为有效区，而其周围可辨标记细胞的区域则为无效区。

  （2）过路纤维问题：路经注射区的纤维也可摄取HRP并被顺、逆向运送。因此，标记部位所出现的神经元或终末，可能并非起于或终止于注射部位。这是在分析结果时经常遇到的问题。

  （3）侧支标记：HRP标记被一轴突末梢摄入后，在其被逆向运送过程中，有一些可以沿该轴突的侧支被顺向运至侧支的末梢，在侧支的末梢部造成终末标记。因此，在一个部位发现终末标记，并不一定说明发出这些纤维的胞体位于注射区内。

  （4）跨突触标记：HRP被运至末梢后，可能被释放出来，并被下一级神经元摄入，甚至再运送至下一级神经元的末梢。这种现象不多见，主要见于用较灵敏的WGA- HRP作追踪剂时，而且是在第一级末梢密集，并与第二级神经元的关系密切的情况下出现。例如，视网膜节细胞末梢内的HRP可能跨突触地标记外侧膝状体神经元。

• Q3: 辣根过氧化物酶法标记伪象怎么判断和排除？

  A：

  （1）神经元以外的其它细胞：在注射部位及其附近的胶质细胞、血管内皮细胞、周细胞、巨噬细胞等可摄入HRP，经反应而着色。这对追踪远距离纤维联系的影响较小，但对短距离联系的研究却有妨碍。一般根据其细胞形状，尤其是核的形态及其与血管腔的关系等，易于与神经细胞区别，而且这些细胞中的反应颗粒常较粗大而大小不均，胞浆也常均匀着色。但有时也可造成鉴别困难，尤其是只有单个细胞时。

  （2）神经元的内源性物质：有的神经元含有脂褐素，随年龄之增长而增多，可能与DAB反应颗粒混淆，在用焦油紫复染的切片上，其暗视野效应还可能加强。在鼠、猴发现某些神经元内可能含有某种内源性酶或其它物质，也可与DAB-H2O2起反应，产生棕色反应物。黑色素或其前身也有类似反应。这些物质都可能成为伪象的来源。因此，对此法之结果的评定应持慎重态度。

• Q4: 荧光素神经元示踪需要注意的问题有哪些？

  A：

  （1）路径选择：荧光素也可用于顺行示踪，但标记较弱，因此不推荐。

  （2）标记方法：不同荧光素具有不同激发波长和发射波长，故可使用双标或多重标记的方法进行标记。但不同荧光素逆行运输速度差别较大，实验时可分两次手术注入荧光素。

  （3）扩散问题：有些荧光素在到达胞体后有扩散出神经元胞体而染出其周围神经胶质细胞的倾向，因此适当存活时间的选择很重要。

  （4）有效注射部位：由于荧光素分子量较小，逆行示踪更易扩散，故比HRP法更难确定有效注射部位。同时也存在存在过路纤维摄入问题，分析结果时需要额外注意。

  （5）褪色问题：荧光素在激发光照射下较快褪色，因此允许观察的时间短。即使在低温、避光条件下，切片保存时间仍有限，不能长期保存。

  （6）优化方法：在50 %甘油和50 %的PBS混合液配制的封片剂中加入2.5%三乙烯二胺（triethylene diamine）可有效地延长观察和保存时间。也可将荧光素包裹在乳胶微球内作追踪剂，减弱扩散、过路纤维和褪色较快的问题。

• Q5: 条件性基因敲除的时间特异性是怎么实现的？

  A：诱导型 Cre-loxP 系统介导了时间特异性基因敲除，通过对给予诱导剂的时间的控制，人为操控基因敲除的发生。

  （1）四环素诱导型 tetO-Cre 将四环素调控系统与Cre-loxP系统相结合，一般需要两种转基因小鼠交配使用：一种是由四环素响应启动子元件（TRE或tetO）控制的 Cre 工具鼠（TRE-Cre，也叫 tetO-Cre）；另一种是由组织特异性启动子驱动的表达四环素转录活化因子 rtTA或 tTA的小鼠。在此过程中，具有转录激活功能的rtTA或者tTA与tetO（tetO无法独立驱动下游基因表达）结合后激活Cre的表达。同时，这种结合受四环素或四环素衍生物强力霉素（Dox）的调节，因此在 tetO-Cre 与组织特异性 rtTA （或 tTA ）双转基因阳性小鼠中，可以通过给予或撤离 Dox 来控制 Cre 重组酶在特定组织中产生的时间。

  （2）干扰素诱导型 Mx1-Cre 干扰素诱导是通过 Mx1 基因启动子对于干扰素的响应来实现的。 Mx1-Cre 小鼠在一般状态下不表达 Cre 重组酶，但可以通过干扰素-α、干扰素-β 或人工合成的双链 RNA类似物poly I:C 的处理而诱导表达 Cre。此方法仅限于响应干扰素的细胞，且其基因敲除效率依赖于组织或细胞对干扰素的响应水平或干扰素响应细胞的数量。

  （3）雌激素诱导型 Cre-ER 将雌激素受体（ER）的配体结合区与 Cre 重组酶相融合，形成定位于胞浆中的融合蛋白（Cre-ER）。这样就通过控制雌激素的注射时间，可以实现对基因重组时间特异性的调控。为了避免内源雌激素的干扰，在人ER的配体结合区进行一个点突变（G521R），使 Cre-ER 只响应外源的人工合成雌激素（比如：Tamoxifen、4-OHT）的诱导。Cre-ER系统，特别是Cre-ERT系统，是目前应用最广泛的诱导型 Cre 系统。只需要将 Cre-ERT2 设计在组织特异性启动子之后，并与 flox 小鼠交配，就可以通过在特定时间点给予 Tamoxifen来最终实现对靶基因的时空特异性敲除。